Diferenciálna diagnostika pľúcnych uzlíkov identifikovaných počítačovou tomografiou (CT) zostáva v klinickej praxi výzvou. V tejto štúdii charakterizujeme globálny metabolom 480 vzoriek séra, vrátane zdravých kontrol, benígnych pľúcnych uzlíkov a adenokarcinómu pľúc v I. štádiu. Adenokarcinómy vykazujú jedinečné metabolomické profily, zatiaľ čo benígne uzlíky a zdraví jedinci majú vysokú podobnosť v metabolomických profiloch. V objavnej skupine (n = 306) bol identifikovaný súbor 27 metabolitov na rozlíšenie medzi benígnymi a malígnymi uzlíkmi. AUC diskriminačného modelu v skupine s internou validáciou (n = 104) a externou validáciou (n = 111) bola 0,915 a 0,945. Analýza dráhy odhalila zvýšené glykolytické metabolity spojené so zníženým tryptofánom v sére pľúcneho adenokarcinómu v porovnaní s benígnymi uzlíkmi a zdravými kontrolami a naznačila, že príjem tryptofánu podporuje glykolýzu v bunkách rakoviny pľúc. Naša štúdia zdôrazňuje hodnotu biomarkerov sérových metabolitov pri hodnotení rizika pľúcnych uzlíkov detegovaných pomocou CT.
Včasná diagnostika je kľúčová pre zlepšenie miery prežitia pacientov s rakovinou. Výsledky americkej Národnej skríningovej štúdie rakoviny pľúc (NLST) a európskej štúdie NELSON ukázali, že skríning pomocou nízkodávkovej počítačovej tomografie (LDCT) môže významne znížiť úmrtnosť na rakovinu pľúc vo vysoko rizikových skupinách1,2,3. Odkedy sa LDCT široko používa na skríning rakoviny pľúc, výskyt náhodných rádiografických nálezov asymptomatických pľúcnych uzlíkov neustále rastie4. Pľúcne uzlíky sú definované ako fokálne opacity s priemerom do 3 cm5. Čelíme ťažkostiam pri posudzovaní pravdepodobnosti malignity a pri riešení veľkého počtu pľúcnych uzlíkov náhodne zistených na LDCT. Obmedzenia CT môžu viesť k častým následným vyšetreniam a falošne pozitívnym výsledkom, čo vedie k zbytočným intervenciám a nadmernej liečbe6. Preto je potrebné vyvinúť spoľahlivé a užitočné biomarkery na správnu identifikáciu rakoviny pľúc v skorých štádiách a rozlíšenie väčšiny benígnych uzlíkov pri počiatočnej detekcii7.
Komplexná molekulárna analýza krvi (sérum, plazma, mononukleárne bunky periférnej krvi), vrátane genomiky, proteomiky alebo metylácie DNA8,9,10, viedla k rastúcemu záujmu o objav diagnostických biomarkerov rakoviny pľúc. Metabolomické prístupy zároveň merajú bunkové konečné produkty, ktoré sú ovplyvnené endogénnymi a exogénnymi účinkami, a preto sa používajú na predpovedanie nástupu a výsledku ochorenia. Kvapalinová chromatografia-tandemová hmotnostná spektrometria (LC-MS) je široko používanou metódou pre metabolomické štúdie vďaka svojej vysokej citlivosti a veľkému dynamickému rozsahu, ktorý dokáže pokryť metabolity s rôznymi fyzikálno-chemickými vlastnosťami11,12,13. Hoci sa globálna metabolomická analýza plazmy/séra používa na identifikáciu biomarkerov spojených s diagnózou rakoviny pľúc14,15,16,17 a účinnosťou liečby,18 klasifikátory sérových metabolitov na rozlíšenie medzi benígnymi a malígnymi pľúcnymi uzlinami si ešte vyžadujú rozsiahly výskum. - rozsiahly výskum.
Adenokarcinóm a spinocelulárny karcinóm sú dva hlavné podtypy nemalobunkového karcinómu pľúc (NSCLC). Rôzne CT skríningové testy naznačujú, že adenokarcinóm je najčastejším histologickým typom rakoviny pľúc1,19,20,21. V tejto štúdii sme použili ultravýkonnú kvapalinovú chromatografiu s hmotnostnou spektrometriou s vysokým rozlíšením (UPLC-HRMS) na vykonanie metabolomickej analýzy celkovo 695 vzoriek séra vrátane zdravých kontrol, benígnych pľúcnych uzlín a CT-detegovaných ≤3 cm. Skríning pľúcneho adenokarcinómu v štádiu I. Identifikovali sme panel sérových metabolitov, ktoré odlišujú pľúcny adenokarcinóm od benígnych uzlín a zdravých kontrol. Analýza obohatenia dráhy odhalila, že abnormálny metabolizmus tryptofánu a glukózy sú bežnými zmenami pri pľúcnom adenokarcinóme v porovnaní s benígnymi uzlinami a zdravými kontrolami. Nakoniec sme vytvorili a validovali sérový metabolický klasifikátor s vysokou špecifickosťou a citlivosťou na rozlíšenie medzi malígnymi a benígnymi pľúcnymi uzlinami detegovanými pomocou LDCT, čo môže pomôcť pri včasnej diferenciálnej diagnostike a hodnotení rizika.
V súčasnej štúdii boli retrospektívne odobraté vzorky séra zodpovedajúce pohlaviu a veku od 174 zdravých kontrolných subjektov, 292 pacientov s benígnymi pľúcnymi uzlinami a 229 pacientov s adenokarcinómom pľúc v štádiu I. Demografické charakteristiky 695 subjektov sú uvedené v doplnkovej tabuľke 1.
Ako je znázornené na obrázku 1a, v Onkologickom centre Sun Yat-senovej univerzity bolo odobratých celkovo 480 vzoriek séra vrátane 174 vzoriek od zdravých kontrolných jedincov (HC), 170 benígnych uzlíkov (BN) a 136 vzoriek pľúcneho adenokarcinómu (LA) v štádiu I. Objavná kohorta pre necielené metabolomické profilovanie pomocou ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie s vysokou rozlišovacou hmotnostnou spektrometriou (UPLC-HRMS). Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 1, boli identifikované rozdielne metabolity medzi LA a HC, LA a BN s cieľom vytvoriť klasifikačný model a ďalej preskúmať analýzu diferenciálnych metabolitových dráh. 104 vzoriek odobratých Onkologickým centrom Sun Yat-senovej univerzity a 111 vzoriek odobratých dvoma ďalšími nemocnicami bolo podrobených internej a externej validácii.
a Študijná populácia v objavnej kohorte, ktorá podstúpila globálnu metabolomickú analýzu séra pomocou ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie s vysokým rozlíšením (UPLC-HRMS). b Diskriminačná analýza metódou parciálnych najmenších štvorcov (PLS-DA) celkového metabolómu 480 vzoriek séra zo študijnej kohorty vrátane zdravých kontrol (HC, n = 174), benígnych uzlíkov (BN, n = 170) a adenokarcinómu pľúc v štádiu I (Los Angeles, n = 136). +ESI, režim pozitívnej elektrosprejovej ionizácie, -ESI, režim negatívnej elektrosprejovej ionizácie. c–e Metabolity s významne odlišným zastúpením v dvoch daných skupinách (obojstranný Wilcoxonov test znamienkových radov, hodnota p upravená podľa miery falošných objavov, FDR <0,05) sú zobrazené červenou farbou (násobná zmena > 1,2) a modrou farbou (násobná zmena < 0,83). ) zobrazené na grafe sopky. f Hierarchická tepelná mapa zhlukovania znázorňujúca významné rozdiely v počte anotovaných metabolitov medzi LA a BN. Zdrojové údaje sa poskytujú vo forme zdrojových dátových súborov.
Celkový sérový metabolom 174 HC, 170 BN a 136 LA v objavnej skupine bol analyzovaný pomocou UPLC-HRMS analýzy. Najprv ukazujeme, že vzorky kontroly kvality (QC) sa tesne zhlukujú v strede modelu nekontrolovanej analýzy hlavných komponentov (PCA), čo potvrdzuje stabilitu výkonnosti súčasnej štúdie (doplnkový obrázok 2).
Ako je znázornené v analýze parciálnych najmenších štvorcov s diskriminačnou metódou (PLS-DA) na obrázku 1b, zistili sme, že medzi LA a BN, LA a HC v pozitívnom (+ESI) a negatívnom (−ESI) režime elektrosprejovej ionizácie existovali jasné rozdiely. Medzi BN a HC v podmienkach +ESI a -ESI sa však nezistili žiadne významné rozdiely.
Medzi LA a HC sme našli 382 diferenciálnych znakov, 231 diferenciálnych znakov medzi LA a BN a 95 diferenciálnych znakov medzi BN a HC (Wilcoxonov test znamienkových radov, FDR <0,05 a viacnásobná zmena >1,2 alebo <0,83) (obrázok .1c-e). Vrcholy boli ďalej anotované (doplnkové údaje 3) oproti databáze (knižnica mzCloud/HMDB/Chemspider) pomocou hodnoty m/z, retenčného času a vyhľadávania hmotnostného spektra fragmentácie (podrobnosti opísané v časti Metódy)22. Nakoniec bolo identifikovaných 33 a 38 anotovaných metabolitov s významnými rozdielmi v množstve pre LA oproti BN (obrázok 1f a doplnková tabuľka 2) a LA oproti HC (doplnkový obrázok 3 a doplnková tabuľka 2). Naproti tomu v BN a HC boli identifikované iba 3 metabolity s významnými rozdielmi v množstve (doplnková tabuľka 2), čo je v súlade s prekrývaním medzi BN a HC v PLS-DA. Tieto diferenciálne metabolity pokrývajú širokú škálu biochemických látok (doplnkový obrázok 4). Tieto výsledky spoločne demonštrujú významné zmeny v sérovom metabolome, ktoré odrážajú malígnu transformáciu rakoviny pľúc v ranom štádiu v porovnaní s benígnymi pľúcnymi uzlinami alebo zdravými jedincami. Podobnosť sérového metabolomu BN a HC naznačuje, že benígne pľúcne uzliny môžu mať so zdravými jedincami mnoho spoločných biologických charakteristík. Vzhľadom na to, že mutácie génu receptora epidermálneho rastového faktora (EGFR) sú bežné pri adenokarcinóme pľúc podtypu 23, snažili sme sa určiť vplyv hnacích mutácií na sérový metabolom. Následne sme analyzovali celkový metabolomický profil 72 prípadov so statusom EGFR v skupine s adenokarcinómom pľúc. Je zaujímavé, že sme v analýze PCA zistili porovnateľné profily medzi pacientmi s mutáciou EGFR (n = 41) a pacientmi s divokým typom EGFR (n = 31) (doplnkový obrázok 5a). Identifikovali sme však 7 metabolitov, ktorých početnosť bola u pacientov s mutáciou EGFR významne zmenená v porovnaní s pacientmi s divokým typom EGFR (t-test, p < 0,05 a násobná zmena > 1,2 alebo < 0,83) (doplnkový obrázok 5b). Väčšina týchto metabolitov (5 zo 7) sú acylkarnitíny, ktoré hrajú dôležitú úlohu v dráhach oxidácie mastných kyselín.
Ako je znázornené v pracovnom postupe na obrázku 2a, biomarkery pre klasifikáciu uzlíkov boli získané pomocou operátorov najmenšieho absolútneho zmrštenia a výberu na základe 33 diferenciálnych metabolitov identifikovaných v LA (n = 136) a BN (n = 170). Najlepšia kombinácia premenných (LASSO) – binárny logistický regresný model. Na testovanie spoľahlivosti modelu bola použitá desaťnásobná krížová validácia. Výber premenných a regularizácia parametrov sú upravené penalizáciou za maximalizáciu pravdepodobnosti s parametrom λ24. Globálna metabolomická analýza bola ďalej vykonaná nezávisle v skupinách internej validácie (n = 104) a externej validácie (n = 111) na testovanie klasifikačnej výkonnosti diskriminačného modelu. V dôsledku toho bolo 27 metabolitov v objavnej sade identifikovaných ako najlepší diskriminačný model s najväčšou priemernou hodnotou AUC (obr. 2b), z ktorých 9 malo zvýšenú aktivitu a 18 zníženú aktivitu v LA v porovnaní s BN (obr. 2c).
Pracovný postup pre vytvorenie klasifikátora pľúcnych uzlíkov vrátane výberu najlepšieho panelu sérových metabolitov v objavovacej sade pomocou binárneho logistického regresného modelu prostredníctvom desaťnásobnej krížovej validácie a vyhodnotenia prediktívnej výkonnosti v interných a externých validačných sadách. b Štatistika krížovej validácie regresného modelu LASSO pre výber metabolických biomarkerov. Uvedené čísla predstavujú priemerný počet biomarkerov vybraných pri danom λ. Červená bodkovaná čiara predstavuje priemernú hodnotu AUC pri zodpovedajúcej lambda. Sivé chybové úsečky predstavujú minimálne a maximálne hodnoty AUC. Bodkovaná čiara označuje najlepší model s 27 vybranými biomarkermi. AUC, plocha pod krivkou ROC (Receiver Operating Characteristic). c Násobok zmien 27 vybraných metabolitov v skupine LA v porovnaní so skupinou BN v objavovacej skupine. Červený stĺpec – aktivácia. Modrý stĺpec predstavuje pokles. d–f Krivky ROC (Receiver Operating Characteristic) znázorňujúce silu diskriminačného modelu na základe 27 kombinácií metabolitov v objavovacích, interných a externých validačných sadách. Zdrojové údaje sú poskytované vo forme zdrojových dátových súborov.
Na základe vážených regresných koeficientov týchto 27 metabolitov bol vytvorený predikčný model (doplnková tabuľka 3). ROC analýza založená na týchto 27 metabolitoch poskytla hodnotu plochy pod krivkou (AUC) 0,933, citlivosť objavovacej skupiny bola 0,868 a špecificita 0,859 (obr. 2d). Medzi 38 anotovanými diferenciálnymi metabolitmi medzi LA a HC dosiahla sada 16 metabolitov hodnotu AUC 0,902 s citlivosťou 0,801 a špecificitou 0,856 pri rozlišovaní LA od HC (doplnkový obrázok 6a-c). Porovnali sa aj hodnoty AUC založené na rôznych prahových hodnotách násobnej zmeny pre diferenciálne metabolity. Zistili sme, že klasifikačný model dosiahol najlepšie výsledky pri rozlišovaní medzi LA a BN (HC), keď bola úroveň násobnej zmeny nastavená na 1,2 oproti 1,5 alebo 2,0 (doplnkový obrázok 7a,b). Klasifikačný model založený na 27 skupinách metabolitov bol ďalej validovaný v interných a externých kohortách. Hodnota AUC bola 0,915 (citlivosť 0,867, špecificita 0,811) pre internú validáciu a 0,945 (citlivosť 0,810, špecificita 0,979) pre externú validáciu (obr. 2e, f). Na posúdenie medzilaboratórnej efektívnosti bolo 40 vzoriek z externej kohorty analyzovaných v externom laboratóriu, ako je opísané v časti Metódy. Presnosť klasifikácie dosiahla AUC 0,925 (doplnkový obrázok 8). Keďže spinocelulárny karcinóm pľúc (LUSC) je druhým najčastejším podtypom nemalobunkového karcinómu pľúc (NSCLC) po adenokarcinóme pľúc (LUAD), testovali sme aj validovaný potenciálny úžitok metabolických profilov. BN a 16 prípadov LUSC. AUC rozlišovacej schopnosti medzi LUSC a BN bola 0,776 (doplnkový obrázok 9), čo naznačuje horšiu schopnosť v porovnaní s rozlišovacou schopnosťou medzi LUAD a BN.
Štúdie ukázali, že veľkosť uzlíkov na CT snímkach pozitívne koreluje s pravdepodobnosťou malignity a zostáva hlavným determinantom liečby uzlíkov25,26,27. Analýza údajov z veľkej kohorty skríningovej štúdie NELSON ukázala, že riziko malignity u subjektov s uzlinami <5 mm bolo dokonca podobné ako u subjektov bez uzlín28. Preto je minimálna veľkosť vyžadujúca pravidelné CT monitorovanie 5 mm, ako odporúča Britská hrudná spoločnosť (BTS), a 6 mm, ako odporúča Fleischnerova spoločnosť29. Avšak uzlíky väčšie ako 6 mm a bez zjavných benígnych znakov, nazývané neurčité pľúcne uzlíky (IPN), zostávajú hlavnou výzvou pri hodnotení a liečbe v klinickej praxi30,31. Ďalej sme skúmali, či veľkosť uzlíkov ovplyvňuje metabolomické podpisy, pomocou združených vzoriek z objavovacích a interných validačných kohort. Zamerali sme sa na 27 validovaných biomarkerov a najprv sme porovnali PCA profily metabolomov HC a BN s veľkosťou pod 6 mm. Zistili sme, že väčšina údajových bodov pre HC a BN sa prekrývala, čo dokazuje, že hladiny metabolitov v sére boli v oboch skupinách podobné (obr. 3a). Mapy znakov v rôznych rozsahoch veľkostí zostali zachované v BN a LA (obr. 3b, c), zatiaľ čo medzi malígnymi a benígnymi uzlinami v rozsahu 6 – 20 mm sa pozorovalo oddelenie (obr. 3d). Táto kohorta mala AUC 0,927, špecificitu 0,868 a citlivosť 0,820 na predpovedanie malignity uzlíkov s veľkosťou 6 až 20 mm (obr. 3e, f). Naše výsledky ukazujú, že klasifikátor dokáže zachytiť metabolické zmeny spôsobené skorou malígnou transformáciou bez ohľadu na veľkosť uzlíkov.
ad Porovnanie profilov PCA medzi špecifikovanými skupinami na základe metabolického klasifikátora 27 metabolitov. CC a BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. v LA 6–20 mm oproti LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm a LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Krivka ROC (Receiver Operating Characteristic) znázorňujúca výkonnosť diskriminačného modelu pre uzliny s veľkosťou 6–20 mm. f Hodnoty pravdepodobnosti boli vypočítané na základe logistického regresného modelu pre uzliny s veľkosťou 6–20 mm. Sivá bodkovaná čiara predstavuje optimálnu medznú hodnotu (0,455). Vyššie uvedené čísla predstavujú percento prípadov predpokladaných pre Los Angeles. Použite obojstranný Studentov t-test. PCA, analýza hlavných komponentov. Plocha pod krivkou AUC. Zdrojové údaje sú poskytované vo forme zdrojových dátových súborov.
Na ilustráciu výkonnosti navrhovaného modelu predikcie malignity boli ďalej vybrané štyri vzorky (vo veku 44 – 61 rokov) s podobnou veľkosťou pľúcnych uzlíkov (7 – 9 mm) (obr. 4a, b). Pri počiatočnom skríningu sa prípad 1 prejavil ako solídny uzlík s kalcifikáciou, čo je znak spojený s benígnym ochorením, zatiaľ čo prípad 2 sa prejavil ako neurčitý čiastočne solídny uzlík bez zjavných benígnych znakov. Tri kolá následných CT vyšetrení ukázali, že tieto prípady zostali stabilné počas 4-ročného obdobia, a preto boli považované za benígne uzlíky (obr. 4a). V porovnaní s klinickým hodnotením sériových CT vyšetrení, jednorazová analýza sérových metabolitov so súčasným klasifikačným modelom rýchlo a správne identifikovala tieto benígne uzlíky na základe pravdepodobnostných obmedzení (tabuľka 1). Obrázok 4b v prípade 3 zobrazuje uzlík so známkami pleurálnej retrakcie, ktorá je najčastejšie spojená s malignitou32. Prípad 4 sa prejavil ako neurčitý čiastočne solídny uzlík bez dôkazu benígnej príčiny. Všetky tieto prípady boli podľa klasifikačného modelu predpovedané ako malígne (tabuľka 1). Posúdenie pľúcneho adenokarcinómu bolo preukázané histopatologickým vyšetrením po resekcii pľúc (obr. 4b). Pre externú validačnú sadu metabolický klasifikátor presne predpovedal dva prípady neurčitých pľúcnych uzlín väčších ako 6 mm (doplnkový obrázok 10).
CT snímky axiálneho okna pľúc dvoch prípadov benígnych uzlíkov. V prípade 1 CT vyšetrenie po 4 rokoch ukázalo stabilný solídny uzlík s rozmermi 7 mm s kalcifikáciou v pravom dolnom laloku. V prípade 2 CT vyšetrenie po 5 rokoch odhalilo stabilný, čiastočne solídny uzlík s priemerom 7 mm v pravom hornom laloku. b CT snímky pľúc v axiálnom okne a zodpovedajúce patologické štúdie dvoch prípadov adenokarcinómu štádia I pred resekciou pľúc. Prípad 3 odhalil uzlík s priemerom 8 mm v pravom hornom laloku s pleurálnou retrakciou. Prípad 4 odhalil čiastočne solídny uzlík typu matného skla s rozmermi 9 mm v ľavom hornom laloku. Farbenie resekovaného pľúcneho tkaniva hematoxylínom a eozínom (H&E) (mierka = 50 μm) demonštrujúce acinárny rastový vzorec pľúcneho adenokarcinómu. Šípky označujú uzlíky detegované na CT snímkach. H&E snímky sú reprezentatívne snímky viacerých (> 3) mikroskopických polí vyšetrených patológom.
Naše výsledky spoločne preukazujú potenciálnu hodnotu biomarkerov sérových metabolitov v diferenciálnej diagnostike pľúcnych uzlín, čo môže predstavovať výzvu pri hodnotení CT skríningu.
Na základe validovaného panelu diferenciálnych metabolitov sme sa snažili identifikovať biologické koreláty hlavných metabolických zmien. Analýza obohatenia dráhy KEGG pomocou MetaboAnalyst identifikovala 6 spoločných významne zmenených dráh medzi dvoma danými skupinami (LA vs. HC a LA vs. BN, upravené p ≤ 0,001, účinok > 0,01). Tieto zmeny boli charakterizované poruchami metabolizmu pyruvátu, metabolizmu tryptofánu, metabolizmu niacínu a nikotínamidu, glykolýzy, cyklu TCA a metabolizmu purínov (Obr. 5a). Následne sme vykonali cielenú metabolomiku na overenie hlavných zmien pomocou absolútnej kvantifikácie. Stanovenie bežných metabolitov v bežne zmenených dráhach pomocou trojitej kvadrupólovej hmotnostnej spektrometrie (QQQ) s použitím autentických štandardov metabolitov. Demografické charakteristiky cieľovej vzorky metabolomickej štúdie sú uvedené v doplnkovej tabuľke 4. V súlade s našimi globálnymi metabolomickými výsledkami kvantitatívna analýza potvrdila, že hypoxantín a xantín, pyruvát a laktát boli v LA zvýšené v porovnaní s BN a HC (obr. 5b, c, p <0,05). Medzi BN a HC sa však nezistili žiadne významné rozdiely v týchto metabolitoch.
Analýza obohatenia dráhy KEGG s signifikantne odlišnými metabolitmi v skupine LA v porovnaní so skupinami BN a HC. Použil sa obojstranný Globaltest a hodnoty p boli upravené pomocou Holm-Bonferroniho metódy (upravené p ≤ 0,001 a veľkosť efektu > 0,01). b–d Violinove grafy znázorňujúce hladiny hypoxantínu, xantínu, laktátu, pyruvátu a tryptofánu v sére HC, BN a LA stanovené pomocou LC-MS/MS (n = 70 na skupinu). Biele a čierne bodkované čiary označujú medián a kvartil. e Violinove grafy znázorňujúce normalizovanú expresiu mRNA SLC7A5 a QPRT Log2TPM (transkripty na milión) v pľúcnom adenokarcinóme (n = 513) v porovnaní s normálnym pľúcnym tkanivom (n = 59) v súbore údajov LUAD-TCGA. Biely rámček predstavuje interkvartilový rozsah, horizontálna čierna čiara v strede predstavuje medián a vertikálna čierna čiara vychádzajúca z rámčeka predstavuje 95 % interval spoľahlivosti (CI). f Pearsonov korelačný graf expresie SLC7A5 a GAPDH v pľúcnom adenokarcinóme (n = 513) a normálnom pľúcnom tkanive (n = 59) v súbore údajov TCGA. Sivá plocha predstavuje 95 % CI. r, Pearsonov korelačný koeficient. g Normalizované hladiny tryptofánu v bunkách A549 transfekovaných nešpecifickou kontrolnou shRNA (NC) a shSLC7A5 (Sh1, Sh2) stanovené pomocou LC-MS/MS. Je prezentovaná štatistická analýza piatich biologicky nezávislých vzoriek v každej skupine. h Bunkové hladiny NADt (celkový NAD, vrátane NAD+ a NADH) v bunkách A549 (NC) a bunkách A549 s knockdownom SLC7A5 (Sh1, Sh2). Je prezentovaná štatistická analýza troch biologicky nezávislých vzoriek v každej skupine. i Glykolytická aktivita buniek A549 pred a po znížení expresie SLC7A5 bola meraná pomocou extracelulárnej miery acidifikácie (ECAR) (n = 4 biologicky nezávislé vzorky na skupinu). 2-DG,2-deoxy-D-glukóza. V (b–h) bol použitý obojstranný Studentov t-test. V (g–i) chybové úsečky predstavujú priemer ± SD, každý experiment bol vykonaný trikrát nezávisle a výsledky boli podobné. Zdrojové údaje sú poskytnuté vo forme zdrojových dátových súborov.
Vzhľadom na významný vplyv zmeneného metabolizmu tryptofánu v skupine LA sme tiež hodnotili hladiny tryptofánu v sére v skupinách HC, BN a LA pomocou QQQ. Zistili sme, že sérový tryptofán bol v skupine LA znížený v porovnaní s HC alebo BN (p < 0,001, obrázok 5d), čo je v súlade s predchádzajúcimi zisteniami, že hladiny tryptofánu v krvnom obehu sú nižšie u pacientov s rakovinou pľúc ako u zdravých kontrolných skupín z kontrolnej skupiny33,34,35. Ďalšia štúdia s použitím PET/CT indikátora 11C-metyl-L-tryptofánu zistila, že retenčný čas signálu tryptofánu v tkanive rakoviny pľúc bol významne zvýšený v porovnaní s benígnymi léziami alebo normálnym tkanivom36. Predpokladáme, že pokles tryptofánu v sére LA môže odrážať aktívne vychytávanie tryptofánu bunkami rakoviny pľúc.
Je tiež známe, že konečným produktom kynurenínovej dráhy katabolizmu tryptofánu je NAD+37,38, ktorý je dôležitým substrátom pre reakciu glyceraldehyd-3-fosfátu s 1,3-bisfosfoglycerátom v glykolýze39. Zatiaľ čo predchádzajúce štúdie sa zameriavali na úlohu katabolizmu tryptofánu v imunitnej regulácii, my sme sa v tejto štúdii snažili objasniť interakciu medzi dysreguláciou tryptofánu a glykolytickými dráhami pozorovanými. Je známe, že člen 5 rodiny transportérov rozpustených látok 7 (SLC7A5) je tryptofánový transportér43,44,45. Fosforibozyltransferáza kyseliny chinolínovej (QPRT) je enzým nachádzajúci sa v smere kynurenínovej dráhy, ktorý premieňa kyselinu chinolínovú na NAMN46. Preskúmanie súboru údajov LUAD TCGA odhalilo, že SLC7A5 aj QPRT boli v nádorovom tkanive významne nadregulované v porovnaní s normálnym tkanivom (Obr. 5e). Toto zvýšenie sa pozorovalo v štádiách I a II, ako aj v štádiách III a IV pľúcneho adenokarcinómu (doplnkový obrázok 11), čo naznačuje skoré poruchy metabolizmu tryptofánu spojené s tumorigenézou.
Súbor údajov LUAD-TCGA navyše ukázal pozitívnu koreláciu medzi expresiou mRNA SLC7A5 a GAPDH vo vzorkách pacientov s rakovinou (r = 0,45, p = 1,55E-26, obrázok 5f). Naproti tomu sa nezistila žiadna významná korelácia medzi takýmito génovými podpismi v normálnom pľúcnom tkanive (r = 0,25, p = 0,06, obrázok 5f). Zníženie expresie SLC7A5 (doplnkový obrázok 12) v bunkách A549 významne znížilo hladiny tryptofánu a NAD(H) v bunkách (obrázok 5g,h), čo viedlo k oslabenej glykolytickej aktivite meranej extracelulárnou rýchlosťou acidifikácie (ECAR) (obrázok 1). 5i). Na základe metabolických zmien v sére a detekcie in vitro teda predpokladáme, že metabolizmus tryptofánu môže produkovať NAD+ prostredníctvom kynurenínovej dráhy a hrať dôležitú úlohu pri podpore glykolýzy pri rakovine pľúc.
Štúdie ukázali, že veľký počet neurčitých pľúcnych uzlíkov zistených pomocou LDCT môže viesť k potrebe dodatočného vyšetrenia, ako je PET-CT, biopsia pľúc a nadmerná liečba z dôvodu falošne pozitívnej diagnózy malignity.31 Ako je znázornené na obrázku 6, naša štúdia identifikovala panel sérových metabolitov s potenciálnou diagnostickou hodnotou, ktoré môžu zlepšiť stratifikáciu rizika a následnú liečbu pľúcnych uzlíkov zistených pomocou CT.
Pľúcne uzliny sa hodnotia pomocou nízkodávkovej počítačovej tomografie (LDCT) so zobrazovacími znakmi naznačujúcimi benígne alebo malígne príčiny. Neistý výsledok liečby uzlíkov môže viesť k častým následným návštevám, zbytočným intervenciám a nadmernej liečbe. Zahrnutie sérových metabolických klasifikátorov s diagnostickou hodnotou môže zlepšiť hodnotenie rizika a následnú liečbu pľúcnych uzlíkov. PET pozitrónová emisná tomografia.
Údaje z americkej štúdie NLST a európskej štúdie NELSON naznačujú, že skríning vysoko rizikových skupín pomocou nízkodávkovej počítačovej tomografie (LDCT) môže znížiť úmrtnosť na rakovinu pľúc1,3. Najnáročnejšie však zostáva hodnotenie rizika a následná klinická liečba veľkého počtu náhodne zistených pľúcnych uzlíkov pomocou LDCT. Hlavným cieľom je optimalizovať správnu klasifikáciu existujúcich protokolov založených na LDCT začlenením spoľahlivých biomarkerov.
Určité molekulárne biomarkery, ako napríklad krvné metabolity, boli identifikované porovnaním rakoviny pľúc so zdravými kontrolami15,17. V tejto štúdii sme sa zamerali na aplikáciu analýzy metabolomiky séra na rozlíšenie medzi benígnymi a malígnymi pľúcnymi uzlinami náhodne zistenými pomocou LDCT. Porovnali sme globálny metabolom séra vzoriek zdravej kontroly (HC), benígnych pľúcnych uzlín (BN) a vzoriek pľúcneho adenokarcinómu (LA) v štádiu I pomocou analýzy UPLC-HRMS. Zistili sme, že HC a BN mali podobné metabolické profily, zatiaľ čo LA vykazovala významné zmeny v porovnaní s HC a BN. Identifikovali sme dve sady sérových metabolitov, ktoré odlišujú LA od HC a BN.
Súčasná schéma identifikácie benígnych a malígnych uzlíkov založená na LDCT je založená hlavne na veľkosti, hustote, morfológii a rýchlosti rastu uzlíkov v priebehu času30. Predchádzajúce štúdie ukázali, že veľkosť uzlíkov úzko súvisí s pravdepodobnosťou rakoviny pľúc. Aj u pacientov s vysokým rizikom je riziko malignity v uzlinách < 6 mm < 1 %. Riziko malignity uzlíkov s veľkosťou 6 až 20 mm sa pohybuje od 8 % do 64 %30. Fleischnerova spoločnosť preto odporúča hraničný priemer 6 mm pre rutinné CT sledovanie.29 Posúdenie rizika a liečba neurčitých pľúcnych uzlíkov (IPN) väčších ako 6 mm však neboli dostatočne vykonané31. Súčasná liečba vrodených srdcových chorôb je zvyčajne založená na bdelom čakaní s častým CT monitorovaním.
Na základe validovaného metabolómu sme po prvýkrát preukázali prekrývanie metabolomických podpisov medzi zdravými jedincami a benígnymi uzlinami <6 mm. Biologická podobnosť je v súlade s predchádzajúcimi zisteniami CT, že riziko malignity uzlíkov <6 mm je rovnako nízke ako u subjektov bez uzlín.30 Treba poznamenať, že naše výsledky tiež ukazujú, že benígne uzliny <6 mm a ≥6 mm majú vysokú podobnosť v metabolomických profiloch, čo naznačuje, že funkčná definícia benígnej etiológie je konzistentná bez ohľadu na veľkosť uzlíkov. Moderné diagnostické panely sérových metabolitov teda môžu poskytnúť jeden test ako vylučovací test, keď sú uzliny pôvodne zistené na CT, a potenciálne znížiť sériové monitorovanie. Zároveň ten istý panel metabolických biomarkerov rozlíšil malígne uzliny s veľkosťou ≥6 mm od benígnych uzlíkov a poskytol presné predpovede pre IPN podobnej veľkosti a nejednoznačných morfologických znakov na CT snímkach. Tento klasifikátor sérového metabolizmu si dobre viedol pri predpovedaní malignity uzlíkov ≥6 mm s AUC 0,927. Naše výsledky spoločne naznačujú, že jedinečné sérové metabolomické signatúry môžu špecificky odrážať skoré metabolické zmeny vyvolané nádorom a majú potenciálnu hodnotu ako prediktory rizika, nezávisle od veľkosti uzlíkov.
Je pozoruhodné, že hlavnými typmi nemalobunkového karcinómu pľúc (NSCLC) sú pľúcny adenokarcinóm (LUAD) a spinocelulárny karcinóm (LUSC). Vzhľadom na to, že LUSC silne súvisí s užívaním tabaku47 a LUAD je najčastejšou histológiou náhodne zistených pľúcnych uzlíkov pri CT skríningu48, náš klasifikačný model bol špeciálne vytvorený pre vzorky adenokarcinómu v štádiu I. Wang a kolegovia sa tiež zamerali na LUAD a identifikovali deväť lipidových podpisov pomocou lipidomiky na rozlíšenie rakoviny pľúc v ranom štádiu od zdravých jedincov17. Súčasný klasifikačný model sme testovali na 16 prípadoch LUSC v štádiu I a 74 benígnych uzlíkov a pozorovali sme nízku presnosť predikcie LUSC (AUC 0,776), čo naznačuje, že LUAD a LUSC môžu mať svoje vlastné metabolomické podpisy. V skutočnosti sa ukázalo, že LUAD a LUSC sa líšia v etiológii, biologickom pôvode a genetických aberáciách49. Preto by sa do tréningových modelov pre populačnú detekciu rakoviny pľúc v skríningových programoch mali zahrnúť aj iné typy histológie.
V tejto štúdii sme identifikovali šesť najčastejšie zmenených metabolických dráh v pľúcnom adenokarcinóme v porovnaní so zdravými kontrolami a benígnymi uzlinami. Xantín a hypoxantín sú bežné metabolity purínovej metabolickej dráhy. V súlade s našimi výsledkami boli medziprodukty spojené s metabolizmom purínov v sére alebo tkanivách pacientov s pľúcnym adenokarcinómom v porovnaní so zdravými kontrolami alebo pacientmi v preinvazívnom štádiu signifikantne zvýšené15,50. Zvýšené hladiny xantínu a hypoxantínu v sére môžu odrážať anabolizmus potrebný pre rýchlo proliferujúce rakovinové bunky. Dysregulácia metabolizmu glukózy je dobre známym znakom metabolizmu rakoviny51. V tejto štúdii sme pozorovali signifikantný nárast pyruvátu a laktátu v skupine LA v porovnaní so skupinou HC a BN, čo je v súlade s predchádzajúcimi správami o abnormalitách glykolytických dráh v profiloch sérového metabolómu u pacientov s nemalobunkovým karcinómom pľúc (NSCLC) a zdravých kontrol. Výsledky sú konzistentné52,53.
Dôležité je, že sme pozorovali inverznú koreláciu medzi metabolizmom pyruvátu a tryptofánu v sére pľúcnych adenokarcinómov. Hladiny tryptofánu v sére boli v skupine LA znížené v porovnaní so skupinou HC alebo BN. Je zaujímavé, že predchádzajúca rozsiahla štúdia s použitím prospektívnej kohorty zistila, že nízke hladiny cirkulujúceho tryptofánu boli spojené so zvýšeným rizikom rakoviny pľúc 54. Tryptofán je esenciálna aminokyselina, ktorú získavame výlučne z potravy. Dospeli sme k záveru, že deplécia tryptofánu v sére pri pľúcnom adenokarcinóme môže odrážať rýchlu depléciu tohto metabolitu. Je dobre známe, že konečný produkt katabolizmu tryptofánu prostredníctvom kynurenínovej dráhy je zdrojom de novo syntézy NAD+. Keďže NAD+ sa produkuje primárne prostredníctvom záchrannej dráhy, význam NAD+ v metabolizme tryptofánu v zdraví a pri chorobe ešte len treba určiť46. Naša analýza databázy TCGA ukázala, že expresia tryptofánového transportéra solutového transportéra 7A5 (SLC7A5) bola významne zvýšená v pľúcnom adenokarcinóme v porovnaní s normálnymi kontrolami a pozitívne korelovala s expresiou glykolytického enzýmu GAPDH. Predchádzajúce štúdie sa zameriavali najmä na úlohu katabolizmu tryptofánu pri potláčaní protinádorovej imunitnej odpovede40,41,42. V tejto štúdii demonštrujeme, že inhibícia vychytávania tryptofánu znížením SLC7A5 v bunkách rakoviny pľúc vedie k následnému zníženiu bunkových hladín NAD a sprievodnému zníženiu glykolytickej aktivity. Stručne povedané, naša štúdia poskytuje biologický základ pre zmeny v sérovom metabolizme spojené s malígnou transformáciou pľúcneho adenokarcinómu.
Mutácie EGFR sú najčastejšími hnacími mutáciami u pacientov s NSCLC. V našej štúdii sme zistili, že pacienti s mutáciou EGFR (n = 41) mali celkové metabolomické profily podobné pacientom s divokým typom EGFR (n = 31), hoci sme u niektorých pacientov s mutáciou EGFR zistili znížené sérové hladiny u pacientov s acylkarnitínom. Zistená funkcia acylkarnitínov je transport acylových skupín z cytoplazmy do mitochondriálnej matrice, čo vedie k oxidácii mastných kyselín za vzniku energie 55. V súlade s našimi zisteniami nedávna štúdia tiež identifikovala podobné metabolomické profily medzi nádormi s mutáciou EGFR a divokým typom EGFR analýzou globálneho metabolómu 102 vzoriek tkaniva pľúcneho adenokarcinómu 50. Je zaujímavé, že obsah acylkarnitínu bol zistený aj v skupine s mutáciou EGFR. Preto si zaslúži ďalšie štúdium, či zmeny hladín acylkarnitínu odrážajú metabolické zmeny vyvolané EGFR a základné molekulárne dráhy.
Záverom, naša štúdia zavádza sérový metabolický klasifikátor pre diferenciálnu diagnostiku pľúcnych uzlín a navrhuje pracovný postup, ktorý môže optimalizovať hodnotenie rizika a uľahčiť klinický manažment na základe CT vyšetrenia.
Túto štúdiu schválila Etická komisia Onkologickej nemocnice Sun Yat-senovej univerzity, Prvá pridružená nemocnica Sun Yat-senovej univerzity a Etická komisia Onkologickej nemocnice Univerzity v Čeng-čou. V skupinách pre objavovanie a internú validáciu bolo odobratých 174 sér od zdravých jedincov a 244 sér z benígnych uzlíkov od jedincov, ktorí sa podrobili každoročným lekárskym prehliadkam na Oddelení kontroly a prevencie rakoviny Onkologického centra Sun Yat-senovej univerzity, a 166 benígnych uzlíkov. Adenokarcinómy pľúc v štádiu I boli odobraté z Onkologického centra Sun Yat-senovej univerzity. V kohorte pre externú validáciu bolo 48 prípadov benígnych uzlíkov, 39 prípadov adenokarcinómu pľúc v štádiu I z Prvej pridruženej nemocnice Sun Yat-senovej univerzity a 24 prípadov adenokarcinómu pľúc v štádiu I z Onkologickej nemocnice v Čeng-čou. Onkologické centrum Sun Yat-senovej univerzity tiež odobralo 16 prípadov dlaždicobunečného karcinómu pľúc v štádiu I na testovanie diagnostickej schopnosti zavedeného metabolického klasifikátora (charakteristiky pacientov sú uvedené v doplnkovej tabuľke 5). Vzorky z objavovacej kohorty a internej validačnej kohorty boli odobraté medzi januárom 2018 a májom 2020. Vzorky pre externú validačnú kohortu boli odobraté medzi augustom 2021 a októbrom 2022. Aby sa minimalizovalo rodové skreslenie, do každej kohorty bol pridelený približne rovnaký počet mužských a ženských prípadov. Tím pre objavovanie a interný hodnotiaci tím. Pohlavie účastníkov bolo určené na základe vlastného hlásenia. Od všetkých účastníkov bol získaný informovaný súhlas a nebola poskytnutá žiadna kompenzácia. Subjekty s benígnymi uzlinami boli tie, ktoré mali stabilné skóre CT vyšetrenia po 2 až 5 rokoch v čase analýzy, s výnimkou 1 prípadu z externej validačnej vzorky, ktorý bol odobratý pred operáciou a diagnostikovaný histopatológiou. S výnimkou chronickej bronchitídy. Prípady adenokarcinómu pľúc boli odobraté pred resekciou pľúc a potvrdené patologickou diagnózou. Vzorky krvi nalačno boli odobraté do skúmaviek na separáciu séra bez akýchkoľvek antikoagulancií. Vzorky krvi boli zrážané 1 hodinu pri izbovej teplote a potom centrifugované pri 2851 × g počas 10 minút pri 4 °C, aby sa odobral supernatant séra. Alikvotné vzorky séra boli zmrazené pri teplote -80 °C až do extrakcie metabolitov. Oddelenie prevencie rakoviny a lekárskeho vyšetrenia Onkologického centra Univerzity Sun Yat-sena odobralo zmes sér od 100 zdravých darcov, vrátane rovnakého počtu mužov a žien vo veku 40 až 55 rokov. Zmiešali sa rovnaké objemy vzorky od každého darcu, výsledná zmes bola rozdelená na alikvotné podiely a uskladnená pri teplote -80 °C. Zmes sér bola použitá ako referenčný materiál na kontrolu kvality a štandardizáciu údajov.
Referenčné sérum a testované vzorky boli rozmrazené a metabolity boli extrahované kombinovanou extrakčnou metódou (MTBE/metanol/voda) 56. Stručne povedané, 50 μl séra bolo zmiešaných s 225 μl ľadovo studeného metanolu a 750 μl ľadovo studeného metyl-terc-butyléteru (MTBE). Zmes bola premiešaná a inkubovaná na ľade počas 1 hodiny. Vzorky boli potom zmiešané a vortexované so 188 μl vody MS kvality obsahujúcej vnútorné štandardy (13C-laktát, 13C3-pyruvát, 13C-metionín a 13C6-izoleucín, zakúpené od Cambridge Isotope Laboratories). Zmes bola potom centrifugovaná pri 15 000 × g počas 10 minút pri 4 °C a spodná fáza bola prenesená do dvoch skúmaviek (každá po 125 μl) na LC-MS analýzu v pozitívnom a negatívnom režime. Nakoniec bola vzorka odparená do sucha vo vysokorýchlostnom vákuovom koncentrátore.
Vysušené metabolity boli rekonštituované v 120 μl 80 % acetonitrilu, vortexované počas 5 minút a centrifugované pri 15 000 × g počas 10 minút pri 4 °C. Supernatanty boli prenesené do jantárových sklenených fľaštičiek s mikrovložkami na metabolomické štúdie. Necielená metabolomická analýza na platforme ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie s vysokým rozlíšením (UPLC-HRMS). Metabolity boli separované pomocou systému Dionex Ultimate 3000 UPLC a kolóny ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). V móde s pozitívnymi iónmi boli mobilné fázy 95 % (A) a 50 % acetonitrilu (B), pričom každá obsahovala 10 mmol/l octanu amónneho a 0,1 % kyseliny mravčej. V negatívnom režime mobilné fázy A a B obsahovali 95 % a 50 % acetonitrilu, pričom obe fázy obsahovali 10 mmol/l octanu amónneho, pH = 9. Gradientný program bol nasledovný: 0–0,5 min, 2 % B; 0,5–12 min, 2–50 % B; 12–14 min, 50–98 % B; 14–16 min, 98 % B; 16–16,1 min, 98 –2 % B; 16,1–20 min, 2 % B. Kolóna sa udržiavala pri teplote 40 °C a vzorka pri teplote 10 °C v automatickom vzorkovači. Prietok bol 0,3 ml/min, vstrekovaný objem bol 3 μl. Hmotnostný spektrometer Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) so zdrojom elektrosprejovej ionizácie (ESI) bol prevádzkovaný v režime úplného skenovania a spojený s monitorovacím režimom ddMS2 na zber veľkých objemov údajov. Parametre MS boli nastavené nasledovne: rozprašovacie napätie +3,8 kV/- 3,2 kV, teplota kapiláry 320 °C, ochranný plyn 40 arb, pomocný plyn 10 arb, teplota ohrievača sondy 350 °C, skenovací rozsah 70–1050 m/h, rozlíšenie 70 000. Dáta boli získané pomocou programu Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Na posúdenie kvality údajov boli vytvorené združené vzorky kontroly kvality (QC) odobratím 10 μl alikvotných podielov supernatantu z každej vzorky. Na začiatku analytickej sekvencie bolo analyzovaných šesť injekcií vzoriek kontroly kvality, aby sa posúdila stabilita systému UPLC-MS. Vzorky kontroly kvality sa potom pravidelne zavádzajú do šarže. Všetkých 11 šarží vzoriek séra v tejto štúdii bolo analyzovaných pomocou LC-MS. Alikvotné podiely zmesi sér od 100 zdravých darcov boli použité ako referenčný materiál v príslušných šaržiach na monitorovanie procesu extrakcie a úpravu vplyvov medzi šaržami. Necielená metabolomická analýza objavnej kohorty, internej validačnej kohorty a externej validačnej kohorty bola vykonaná v Metabolomickom centre Univerzity Sun Yat-sena. Externé laboratórium Analytického a testovacieho centra Technologickej univerzity v Guangdongu tiež analyzovalo 40 vzoriek z externej kohorty na testovanie výkonnosti klasifikačného modelu.
Po extrakcii a rekonštitúcii sa absolútna kvantifikácia sérových metabolitov merala pomocou ultravysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie s tandemovou hmotnostnou spektrometriou (Agilent 6495 trojitý kvadrupól) so zdrojom elektrosprejovej ionizácie (ESI) v režime monitorovania viacerých reakcií (MRM). Na oddelenie metabolitov sa použila kolóna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Mobilná fáza pozostávala z 90 % (A) a 5 % acetonitrilu (B) s 10 mmol/l octanu amónneho a 0,1 % roztoku amoniaku. Gradientný program bol nasledovný: 0–1,5 min, 0 % B; 1,5–6,5 min, 0–15 % B; 6,5–8 min, 15 % B; 8–8,5 min, 15 %–0 % B; 8,5–11,5 min, 0 % B. Kolóna sa udržiavala pri teplote 40 °C a vzorka pri teplote 10 °C v automatickom vzorkovači. Prietok bol 0,3 ml/min a vstrekovaný objem bol 1 μl. Parametre MS boli nastavené nasledovne: kapilárne napätie ±3,5 kV, tlak v rozprašovači 35 psi, prietok plášťového plynu 12 l/min, teplota plášťového plynu 350 °C, teplota sušiaceho plynu 250 °C a prietok sušiaceho plynu 14 l/min. MRM konverzie tryptofánu, pyruvátu, laktátu, hypoxantínu a xantínu boli 205,0 – 187,9, 87,0 – 43,4, 89,0 – 43,3, 135,0 – 92,3 a 151,0 – 107,9. Údaje sa zbierali pomocou softvéru Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). V prípade vzoriek séra bol tryptofán, pyruvát, laktát, hypoxantín a xantín kvantifikovaný pomocou kalibračných kriviek štandardných zmesí roztokov. V prípade vzoriek buniek bol obsah tryptofánu normalizovaný na interný štandard a hmotnosť bunkových proteínov.
Extrakcia píku (m/z a retenčný čas (RT)) sa uskutočnila pomocou softvéru Compound Discovery 3.1 a TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Aby sa eliminovali potenciálne rozdiely medzi šaržami, každý charakteristický pík testovanej vzorky sa vydelil charakteristickým píkom referenčného materiálu z tej istej šarže, aby sa získala relatívna abundancia. Relatívne štandardné odchýlky vnútorných štandardov pred a po štandardizácii sú uvedené v doplnkovej tabuľke 6. Rozdiely medzi týmito dvoma skupinami boli charakterizované mierou falošných objavov (FDR < 0,05, Wilcoxon signed rank test) a násobnou zmenou (> 1,2 alebo < 0,83). Nespracované MS dáta extrahovaných znakov a MS dáta korigované referenčným sérom sú uvedené v doplnkových údajoch 1 a doplnkových údajoch 2. Anotácia píku sa vykonala na základe štyroch definovaných úrovní identifikácie, vrátane identifikovaných metabolitov, údajne anotovaných zlúčenín, údajne charakterizovaných tried zlúčenín a neznámych zlúčenín 22. Na základe vyhľadávania v databáze v Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) boli ako medziprodukty medzi diferenciálnym metabolómom nakoniec vybrané biologické zlúčeniny s validovanými štandardmi zodpovedajúcimi MS/MS alebo anotáciami presnej zhody v mzCloud (skóre > 85) alebo Chemspider. Anotácie píkov pre každý znak sú zahrnuté v doplnkových údajoch 3. Na univariačnú analýzu sumárne normalizovanej abundancie metabolitov bol použitý MetaboAnalyst 5.0. MetaboAnalyst 5.0 tiež vyhodnotil analýzu obohatenia dráhy KEGG na základe významne odlišných metabolitov. Analýza hlavných komponentov (PCA) a diskriminačná analýza čiastočných najmenších štvorcov (PLS-DA) boli analyzované pomocou softvérového balíka ropls (v.1.26.4) s normalizáciou zásobníka a automatickým škálovaním. Optimálny model biomarkera metabolitov na predpovedanie malignity uzlíkov bol vygenerovaný pomocou binárnej logistickej regresie s najmenším absolútnym zmenšením a operátorom výberu (LASSO, balík R v.4.1-3). Výkonnosť diskriminačného modelu v detekčných a validačných súboroch bola charakterizovaná odhadom AUC na základe ROC analýzy podľa balíka pROC (v.1.18.0.). Optimálna hranica pravdepodobnosti bola získaná na základe maximálneho Youdenovho indexu modelu (citlivosť + špecificita – 1). Vzorky s hodnotami menšími alebo väčšími ako prahová hodnota budú predpovedané ako benígne uzliny a adenokarcinóm pľúc.
Bunky A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) boli pestované v médiu F-12K obsahujúcom 10 % FBS. Sekvencie krátkej vlásenkovej RNA (shRNA) zamerané na SLC7A5 a necieľovú kontrolu (NC) boli vložené do lentivírusového vektora pLKO.1-puro. Antisense sekvencie shSLC7A5 sú nasledovné: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Protilátky proti SLC7A5 (#5347) a tubulínu (#2148) boli zakúpené od spoločnosti Cell Signaling Technology. Protilátky proti SLC7A5 a tubulínu boli použité v riedení 1:1000 na Western blot analýzu.
Test glykolytického stresu Seahorse XF meria hladiny extracelulárnej acidifikácie (ECAR). V teste sa postupne podávala glukóza, oligomycín A a 2-DG na testovanie bunkovej glykolytickej kapacity meranej pomocou ECAR.
Bunky A549 transfekované necieľovou kontrolou (NC) a shSLC7A5 (Sh1, Sh2) boli cez noc umiestnené na misky s priemerom 10 cm. Bunkové metabolity boli extrahované 1 ml ľadovo studeného 80 % vodného metanolu. Bunky v metanolovom roztoku boli zoškrabané, zozbierané do novej skúmavky a centrifugované pri 15 000 × g počas 15 minút pri 4 °C. Zozbierajte 800 µl supernatantu a vysušte pomocou vysokorýchlostného vákuového koncentrátora. Vysušené pelety metabolitov boli potom analyzované na hladiny tryptofánu pomocou LC-MS/MS, ako je opísané vyššie. Hladiny bunkového NAD(H) v bunkách A549 (NC a shSLC7A5) boli merané pomocou kvantitatívnej kolorimetrickej súpravy NAD+/NADH (#K337, BioVision) podľa pokynov výrobcu. Hladiny proteínov boli merané pre každú vzorku, aby sa normalizovalo množstvo metabolitov.
Na predbežné určenie veľkosti vzorky neboli použité žiadne štatistické metódy. Predchádzajúce metabolomické štúdie zamerané na objavenie biomarkerov15,18 boli považované za referenčné hodnoty pre určenie veľkosti a v porovnaní s týmito správami bola naša vzorka adekvátna. Z kohorty štúdie neboli vylúčené žiadne vzorky. Vzorky séra boli náhodne rozdelené do objavovacej skupiny (306 prípadov, 74,6 %) a internej validačnej skupiny (104 prípadov, 25,4 %) pre necielené metabolomické štúdie. Z objavovacej sady pre cielené metabolomické štúdie sme tiež náhodne vybrali 70 prípadov z každej skupiny. Výskumníci boli počas zberu a analýzy údajov LC-MS zaslepení, pokiaľ ide o zaradenie do skupín. Štatistické analýzy metabolomických údajov a bunkových experimentov sú opísané v príslušných častiach Výsledky, Legendy k obrázkom a Metódy. Kvantifikácia bunkovej tryptofánu, NADT a glykolytickej aktivity bola vykonaná trikrát nezávisle s identickými výsledkami.
Viac informácií o dizajne štúdie nájdete v abstrakte správy o prirodzenom portfóliu, ktorý je súčasťou tohto článku.
Nespracované MS dáta extrahovaných znakov a normalizované MS dáta referenčného séra sú uvedené v doplnkových údajoch 1 a 2. Anotácie píkov pre diferenciálne znaky sú uvedené v doplnkových údajoch 3. Súbor údajov LUAD TCGA si môžete stiahnuť z https://portal.gdc.cancer.gov/. Vstupné dáta pre vykreslenie grafu sú uvedené v zdrojových údajoch. Zdrojové dáta sú uvedené pre tento článok.
Národná skupina pre štúdium skríningu pľúc atď. Zníženie úmrtnosti na rakovinu pľúc pomocou nízkodávkovej počítačovej tomografie. Severné Anglicko. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR a Prophet, PC Skríning rakoviny pľúc pomocou nízkodávkovej helikálnej počítačovej tomografie (CT): výsledky Národnej štúdie skríningu pľúc (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ a kol. Zníženie úmrtnosti na rakovinu pľúc pomocou volumetrického CT skríningu v randomizovanej štúdii. Severné Anglicko. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Čas uverejnenia: 18. septembra 2023