Diferenciálna diagnostika pľúcnych uzlín identifikovaných počítačovou tomografiou (CT) zostáva výzvou v klinickej praxi.Tu charakterizujeme globálny metabolóm 480 vzoriek séra vrátane zdravých kontrol, benígnych pľúcnych uzlín a adenokarcinómu pľúc v štádiu I.Adenokarcinómy vykazujú jedinečné metabolomické profily, zatiaľ čo benígne uzliny a zdraví jedinci majú vysokú podobnosť v metabolomických profiloch.V skupine objaviteľov (n = 306) bol identifikovaný súbor 27 metabolitov na rozlíšenie medzi benígnymi a malígnymi uzlinami.AUC diskriminačného modelu v skupine s internou validáciou (n = 104) a externou validáciou (n = 111) bola 0,915, respektíve 0,945.Analýza dráhy odhalila zvýšené glykolytické metabolity spojené so znížením tryptofánu v sére adenokarcinómu pľúc v porovnaní s benígnymi uzlinami a zdravými kontrolami a naznačila, že vychytávanie tryptofánu podporuje glykolýzu v bunkách rakoviny pľúc.Naša štúdia zdôrazňuje hodnotu biomarkerov sérových metabolitov pri hodnotení rizika pľúcnych uzlín detegovaných CT.
Včasná diagnóza je rozhodujúca pre zlepšenie miery prežitia u pacientov s rakovinou.Výsledky amerického Národného skríningového testu rakoviny pľúc (NLST) a európskej štúdie NELSON ukázali, že skríning pomocou počítačovej tomografie s nízkou dávkou (LDCT) môže významne znížiť úmrtnosť na rakovinu pľúc vo vysoko rizikových skupinách1,2,3.Od rozšíreného používania LDCT na skríning rakoviny pľúc sa výskyt náhodných rádiografických nálezov asymptomatických pľúcnych uzlín naďalej zvyšuje 4 .Pľúcne uzliny sú definované ako fokálne opacity do priemeru 3 cm5.Čelíme ťažkostiam pri hodnotení pravdepodobnosti malignity a pri riešení veľkého počtu pľúcnych uzlín náhodne zistených pri LDCT.Obmedzenia CT môžu viesť k častým kontrolným vyšetreniam a falošne pozitívnym výsledkom, čo vedie k zbytočnej intervencii a nadmernej liečbe6.Preto je potrebné vyvinúť spoľahlivé a užitočné biomarkery na správnu identifikáciu rakoviny pľúc v skorých štádiách a na odlíšenie väčšiny benígnych uzlín pri počiatočnej detekcii 7 .
Komplexná molekulárna analýza krvi (sérum, plazma, mononukleárne bunky periférnej krvi), vrátane genomiky, proteomiky alebo metylácie DNA8,9,10, viedla k rastúcemu záujmu o objavenie diagnostických biomarkerov pre rakovinu pľúc.Medzitým, metabolomické prístupy merajú bunkové konečné produkty, ktoré sú ovplyvnené endogénnymi a exogénnymi účinkami, a preto sa používajú na predpovedanie nástupu a výsledku ochorenia.Kvapalinová chromatografia-tandemová hmotnostná spektrometria (LC-MS) je široko používaná metóda pre metabolomické štúdie vďaka vysokej citlivosti a veľkému dynamickému rozsahu, ktorý dokáže pokryť metabolity s rôznymi fyzikálno-chemickými vlastnosťami11,12,13.Aj keď sa na identifikáciu biomarkerov spojených s diagnózou rakoviny pľúc14,15,16,17 a účinnosťou liečby použila globálna metabolomická analýza plazmy/séra,18 klasifikátory sérových metabolitov na rozlíšenie medzi benígnymi a malígnymi pľúcnymi uzlinami je potrebné ešte veľa preštudovať.- masívny výskum.
Adenokarcinóm a spinocelulárny karcinóm sú dva hlavné podtypy nemalobunkového karcinómu pľúc (NSCLC).Rôzne skríningové CT testy naznačujú, že adenokarcinóm je najčastejším histologickým typom rakoviny pľúc1,19,20,21.V tejto štúdii sme použili ultravýkonnú kvapalinovú chromatografiu s vysokým rozlíšením hmotnostnej spektrometrie (UPLC-HRMS) na vykonanie metabolomickej analýzy na celkovo 695 vzorkách séra, vrátane zdravých kontrol, benígnych pľúcnych uzlín a CT detegovaných ≤3 cm.Skríning adenokarcinómu pľúc I. štádia.Identifikovali sme panel sérových metabolitov, ktoré odlišujú pľúcny adenokarcinóm od benígnych uzlín a zdravých kontrol.Analýza obohatenia dráhy odhalila, že abnormálny metabolizmus tryptofánu a glukózy sú bežné zmeny v adenokarcinóme pľúc v porovnaní s benígnymi uzlinami a zdravými kontrolami.Nakoniec sme vytvorili a validovali sérový metabolický klasifikátor s vysokou špecifickosťou a citlivosťou na rozlíšenie medzi malígnymi a benígnymi pľúcnymi uzlinami zistenými pomocou LDCT, čo môže pomôcť pri včasnej diferenciálnej diagnostike a hodnotení rizika.
V súčasnej štúdii boli retrospektívne odobraté vzorky séra zodpovedajúceho pohlavia a veku od 174 zdravých kontrol, 292 pacientov s benígnymi pľúcnymi uzlinami a 229 pacientov s adenokarcinómom pľúc v štádiu I.Demografické charakteristiky 695 subjektov sú uvedené v doplnkovej tabuľke 1.
Ako je znázornené na obrázku 1a, celkovo 480 vzoriek séra vrátane 174 zdravých kontrol (HC), 170 vzoriek benígnych uzlín (BN) a 136 vzoriek adenokarcinómu pľúc v štádiu I (LA) sa odobralo v Sun Yat-sen University Cancer Center.Objavovacia kohorta pre necielené metabolomické profilovanie pomocou ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie-hmotnostnej spektrometrie s vysokým rozlíšením (UPLC-HRMS).Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 1, boli identifikované rozdielne metabolity medzi LA a HC, LA a BN, aby sa vytvoril klasifikačný model a ďalej sa preskúmala analýza diferenciálnej dráhy.104 vzoriek odobratých v Sun Yat-sen University Cancer Center a 111 vzoriek odobratých v dvoch ďalších nemocniciach bolo podrobených internej a externej validácii.
Študijná populácia vo výskumnej kohorte, ktorá podstúpila globálnu metabolomickú analýzu séra pomocou ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie s vysokým rozlíšením hmotnostnej spektrometrie (UPLC-HRMS).b Čiastočná diskriminačná analýza najmenších štvorcov (PLS-DA) celkového metabolómu 480 vzoriek séra zo študijnej kohorty, vrátane zdravých kontrol (HC, n = 174), benígnych uzlín (BN, n = 170) a adenokarcinómu pľúc štádia I (Los Angeles, n = 136).+ESI, režim pozitívnej elektrosprejovej ionizácie, -ESI, režim negatívnej elektrosprejovej ionizácie.c–e metabolity s výrazne odlišnými abundanciami v dvoch daných skupinách (obojstranný Wilcoxonov podpísaný rank test, hodnota p upravená mierou falošných objavov, FDR <0,05) sú zobrazené červenou (násobná zmena > 1,2) a modrou (násobná zmena < 0,83) .) zobrazené na obrázku sopky.f Hierarchická klastrová tepelná mapa ukazujúca významné rozdiely v počte anotovaných metabolitov medzi LA a BN.Zdrojové dáta sú poskytované vo forme zdrojových dátových súborov.
Celkový sérový metabolóm 174 HC, 170 BN a 136 LA v objaviteľskej skupine sa analyzoval pomocou analýzy UPLC-HRMS.Najprv ukážeme, že vzorky kontroly kvality (QC) sa tesne zhlukujú v strede modelu analýzy hlavných komponentov (PCA) bez dozoru, čo potvrdzuje stabilitu výkonu súčasnej štúdie (doplnkový obrázok 2).
Ako je znázornené v čiastočnej diskriminačnej analýze najmenších štvorcov (PLS-DA) na obrázku 1b, zistili sme, že existujú jasné rozdiely medzi LA a BN, LA a HC v pozitívnych (+ESI) a negatívnych (-ESI) režimoch elektrosprejovej ionizácie. .izolovaný.Neboli však zistené žiadne významné rozdiely medzi BN a HC v podmienkach +ESI a -ESI.
Zistili sme 382 rozdielnych znakov medzi LA a HC, 231 rozdielnych znakov medzi LA a BN a 95 rozdielnych znakov medzi BN a HC (Wilcoxonov podpísaný poradový test, FDR <0,05 a viacnásobná zmena >1,2 alebo <0,83) (obrázok .1c-e )..Vrcholy boli ďalej anotované (doplnkové údaje 3) oproti databáze (knižnica mzCloud/HMDB/Chemspider) hodnotou m/z, retenčným časom a fragmentačným hmotnostným spektrom vyhľadávania (podrobnosti opísané v časti Metódy)22.Nakoniec sa identifikovalo 33 a 38 anotovaných metabolitov s významnými rozdielmi v množstve pre LA oproti BN (obrázok 1f a doplnková tabuľka 2) a LA oproti HC (doplnkový obrázok 3 a doplnková tabuľka 2).Na rozdiel od toho boli v BN a HC identifikované iba 3 metabolity s významnými rozdielmi v množstve (doplnková tabuľka 2), čo je v súlade s prekrývaním medzi BN a HC v PLS-DA.Tieto rozdielne metabolity pokrývajú širokú škálu biochemikálií (doplnkový obrázok 4).Celkovo tieto výsledky demonštrujú významné zmeny v sérovom metabolóme, ktoré odrážajú malígnu transformáciu rakoviny pľúc v počiatočnom štádiu v porovnaní s benígnymi pľúcnymi uzlinami alebo zdravými jedincami.Medzitým podobnosť sérového metabolómu BN a HC naznačuje, že benígne pľúcne uzliny môžu zdieľať mnohé biologické charakteristiky so zdravými jedincami.Vzhľadom na to, že génové mutácie receptora epidermálneho rastového faktora (EGFR) sú bežné v pľúcnom adenokarcinóme podtypu 23, snažili sme sa určiť vplyv vodičových mutácií na sérový metabolóm.Potom sme analyzovali celkový metabolomický profil 72 prípadov so stavom EGFR v skupine s adenokarcinómom pľúc.Je zaujímavé, že sme našli porovnateľné profily medzi pacientmi s mutantom EGFR (n = 41) a pacientmi s divokým typom EGFR (n = 31) v analýze PCA (doplnkový obrázok 5a).Identifikovali sme však 7 metabolitov, ktorých množstvo sa významne zmenilo u pacientov s mutáciou EGFR v porovnaní s pacientmi s divokým typom EGFR (t test, p < 0,05 a násobná zmena > 1,2 alebo < 0,83) (doplnkový obrázok 5b).Väčšinu týchto metabolitov (5 zo 7) tvoria acylkarnitíny, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu v procesoch oxidácie mastných kyselín.
Ako je znázornené v pracovnom postupe znázornenom na obrázku 2a, biomarkery na klasifikáciu uzlín sa získali pomocou operátorov najmenšieho absolútneho zmršťovania a výberu na základe 33 rozdielnych metabolitov identifikovaných v LA (n = 136) a BN (n = 170).Najlepšia kombinácia premenných (LASSO) – binárny logistický regresný model.Na testovanie spoľahlivosti modelu sa použila desaťnásobná krížová validácia.Výber premennej a regularizácia parametrov sa upraví pomocou penalizácie za maximalizáciu pravdepodobnosti s parametrom λ24.Globálna metabolomická analýza sa ďalej vykonala nezávisle v skupine internej validácie (n = 104) a externej validácie (n = 111), aby sa otestovala klasifikačná výkonnosť diskriminačného modelu.Výsledkom bolo, že 27 metabolitov v súbore objavov bolo identifikovaných ako najlepší diskriminačný model s najväčšou strednou hodnotou AUC (obr. 2b), z ktorých 9 malo zvýšenú aktivitu a 18 zníženú aktivitu v LA v porovnaní s BN (obr. 2c).
Pracovný postup na vytvorenie klasifikátora pľúcnych uzlín vrátane výberu najlepšieho panelu sérových metabolitov v súbore objavov pomocou binárneho logistického regresného modelu prostredníctvom desaťnásobnej krížovej validácie a hodnotenia prediktívnej výkonnosti v súboroch interných a externých validácií.b Štatistika krížovej validácie regresného modelu LASSO pre výber metabolických biomarkerov.Čísla uvedené vyššie predstavujú priemerný počet biomarkerov vybraných pri danom λ.Červená bodkovaná čiara predstavuje priemernú hodnotu AUC pri zodpovedajúcej lambda.Šedé chybové stĺpce predstavujú minimálne a maximálne hodnoty AUC.Bodkovaná čiara označuje najlepší model s 27 vybranými biomarkermi.AUC, plocha pod krivkou prevádzkovej charakteristiky prijímača (ROC).c Znásobené zmeny 27 vybraných metabolitov v skupine LA v porovnaní so skupinou BN v skupine objaviteľov.Červený stĺpec – aktivácia.Modrý stĺpec je pokles.d–f Krivky prevádzkových charakteristík prijímača (ROC) ukazujúce silu diskriminačného modelu založeného na 27 kombináciách metabolitov v súboroch objavovania, internej a externej validácie.Zdrojové dáta sú poskytované vo forme zdrojových dátových súborov.
Predikčný model bol vytvorený na základe vážených regresných koeficientov týchto 27 metabolitov (doplnková tabuľka 3).ROC analýza založená na týchto 27 metabolitoch poskytla hodnotu plochy pod krivkou (AUC) 0,933, citlivosť objavenej skupiny bola 0,868 a špecificita bola 0,859 (obr. 2d).Medzitým medzi 38 anotovanými diferenciálnymi metabolitmi medzi LA a HC dosiahol súbor 16 metabolitov AUC 0,902 so senzitivitou 0,801 a špecificitou 0,856 pri rozlišovaní LA od HC (doplnkový obrázok 6a-c).Porovnávali sa aj hodnoty AUC založené na rôznych prahoch násobnej zmeny pre rôzne metabolity.Zistili sme, že klasifikačný model fungoval najlepšie pri rozlišovaní medzi LA a BN (HC), keď bola úroveň násobnej zmeny nastavená na 1,2 oproti 1,5 alebo 2,0 (doplnkový obrázok 7a, b).Klasifikačný model založený na 27 skupinách metabolitov bol ďalej validovaný v interných a externých kohortách.AUC bola 0,915 (citlivosť 0,867, špecifickosť 0,811) pre internú validáciu a 0,945 (senzitivita 0,810, špecifickosť 0,979) pre externú validáciu (obr. 2e, f).Na posúdenie medzilaboratórnej účinnosti sa 40 vzoriek z externej kohorty analyzovalo v externom laboratóriu, ako je opísané v časti Metódy.Presnosť klasifikácie dosiahla AUC 0,925 (doplnkový obrázok 8).Pretože karcinóm skvamóznych buniek pľúc (LUSC) je druhým najbežnejším podtypom nemalobunkového karcinómu pľúc (NSCLC) po adenokarcinóme pľúc (LUAD), testovali sme aj overenú potenciálnu užitočnosť metabolických profilov.BN a 16 prípadov LUSC.AUC diskriminácie medzi LUSC a BN bola 0, 776 (doplnkový obrázok 9), čo naznačuje horšiu schopnosť v porovnaní s diskrimináciou medzi LUAD a BN.
Štúdie ukázali, že veľkosť uzlín na CT snímkach pozitívne koreluje s pravdepodobnosťou malignity a zostáva hlavným determinantom liečby uzlín25,26,27.Analýza údajov z veľkej kohorty skríningovej štúdie NELSON ukázala, že riziko malignity u jedincov s uzlinami < 5 mm bolo dokonca podobné ako u jedincov bez uzlín28.Preto je minimálna veľkosť vyžadujúca pravidelné CT monitorovanie 5 mm, ako odporúča Britská hrudná spoločnosť (BTS), a 6 mm, ako odporúča Fleischnerova spoločnosť 29 .Noduly väčšie ako 6 mm a bez zjavných benígnych znakov, nazývané indeterminate pulmonary nodules (IPN), však zostávajú hlavnou výzvou pri hodnotení a manažmente v klinickej praxi30,31.Ďalej sme skúmali, či veľkosť uzlín ovplyvnila metabolomické podpisy pomocou združených vzoriek z kohorty objavovania a internej validácie.So zameraním na 27 validovaných biomarkerov sme najprv porovnali PCA profily HC a BN sub-6 mm metabolómov.Zistili sme, že väčšina údajových bodov pre HC a BN sa prekrývala, čo dokazuje, že hladiny metabolitov v sére boli podobné v oboch skupinách (obr. 3a).Charakteristické mapy v rôznych rozsahoch veľkostí zostali zachované v BN a LA (obr. 3b, c), zatiaľ čo medzi malígnymi a benígnymi uzlinami bolo pozorované oddelenie v rozsahu 6–20 mm (obr. 3d).Táto kohorta mala AUC 0,927, špecificitu 0,868 a citlivosť 0,820 na predpovedanie malignity uzlín s rozmermi 6 až 20 mm (obr. 3e, f).Naše výsledky ukazujú, že klasifikátor dokáže zachytiť metabolické zmeny spôsobené včasnou malígnou transformáciou bez ohľadu na veľkosť uzliny.
ad Porovnanie PCA profilov medzi špecifikovanými skupinami na základe metabolického klasifikátora 27 metabolitov.CC a BN < 6 mm.b BN < 6 mm oproti BN 6–20 mm.v LA 6–20 mm oproti LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm a LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Krivka prevádzkovej charakteristiky prijímača (ROC) znázorňujúca výkon diskriminačného modelu pre uzliny 6–20 mm.f Hodnoty pravdepodobnosti boli vypočítané na základe modelu logistickej regresie pre uzliny s rozmermi 6–20 mm.Sivá bodkovaná čiara predstavuje optimálnu medznú hodnotu (0,455).Vyššie uvedené čísla predstavujú percento predpokladaných prípadov pre Los Angeles.Použite dvojstranný Studentov t test.PCA, analýza hlavných komponentov.AUC plocha pod krivkou.Zdrojové dáta sú poskytované vo forme zdrojových dátových súborov.
Ďalej boli vybrané štyri vzorky (vo veku 44–61 rokov) s podobnou veľkosťou pľúcnych uzlín (7–9 mm), aby ilustrovali výkonnosť navrhovaného modelu predikcie malignity (obr. 4a, b).Pri počiatočnom skríningu sa prípad 1 prezentoval ako solídny uzol s kalcifikáciou, čo je znak spojený s benígnosťou, zatiaľ čo prípad 2 sa prezentoval ako neurčitý čiastočne pevný uzol bez zjavných benígnych znakov.Tri kolá následných CT vyšetrení ukázali, že tieto prípady zostali stabilné počas 4-ročného obdobia, a preto sa považovali za benígne uzliny (obr. 4a).V porovnaní s klinickým hodnotením sériových CT skenov, jednorazová analýza sérových metabolitov so súčasným modelom klasifikátora rýchlo a správne identifikovala tieto benígne uzliny na základe pravdepodobnostných obmedzení (tabuľka 1).Obrázok 4b v prípade 3 ukazuje uzol so známkami pleurálnej retrakcie, ktorá je najčastejšie spojená s malignitou32.Prípad 4 prezentovaný ako neurčitý čiastočne pevný uzol bez dôkazu benígnej príčiny.Všetky tieto prípady boli predpovedané ako malígne podľa modelu klasifikátora (tabuľka 1).Posúdenie pľúcneho adenokarcinómu bolo preukázané histopatologickým vyšetrením po resekčnej operácii pľúc (obr. 4b).Pre externý validačný súbor metabolický klasifikátor presne predpovedal dva prípady neurčitých pľúcnych uzlín väčších ako 6 mm (doplnkový obrázok 10).
CT snímky axiálneho okna pľúc dvoch prípadov benígnych uzlín.V prípade 1 CT vyšetrenie po 4 rokoch ukázalo stabilný solídny uzol veľkosti 7 mm s kalcifikáciou v pravom dolnom laloku.V prípade 2 CT vyšetrenie po 5 rokoch odhalilo stabilný, čiastočne pevný uzol s priemerom 7 mm v pravom hornom laloku.b CT snímky pľúc v axiálnom okne a zodpovedajúce patologické štúdie dvoch prípadov adenokarcinómu štádia I pred resekciou pľúc.Prípad 3 odhalil uzol s priemerom 8 mm v pravom hornom laloku s pleurálnou retrakciou.Prípad 4 odhalil čiastočne pevný uzlík zo zábrusu s veľkosťou 9 mm v ľavom hornom laloku.Farbenie resekovaného pľúcneho tkaniva hematoxylínom a eozínom (H&E) (stupnica = 50 μm) demonštrujúce acinárny rastový vzor pľúcneho adenokarcinómu.Šípky označujú uzliny zistené na snímkach CT.H&E snímky sú reprezentatívne snímky viacerých (>3) mikroskopických polí skúmaných patológom.
Celkovo naše výsledky demonštrujú potenciálnu hodnotu biomarkerov sérových metabolitov v diferenciálnej diagnostike pľúcnych uzlín, čo môže predstavovať výzvy pri hodnotení CT skríningu.
Na základe overeného panelu diferenciálnych metabolitov sme sa snažili identifikovať biologické koreláty hlavných metabolických zmien.Analýza obohatenia KEGG dráhy pomocou MetaboAnalyst identifikovala 6 bežných významne zmenených dráh medzi dvoma danými skupinami (LA vs. HC a LA vs. BN, upravené p ≤ 0,001, účinok > 0,01).Tieto zmeny boli charakterizované poruchami metabolizmu pyruvátu, metabolizmu tryptofánu, metabolizmu niacínu a nikotínamidu, glykolýzy, cyklu TCA a metabolizmu purínov (obr. 5a).Potom sme ďalej vykonali cielenú metabolomiku, aby sme overili hlavné zmeny pomocou absolútnej kvantifikácie.Stanovenie bežných metabolitov v bežne zmenených dráhach pomocou trojitej kvadrupólovej hmotnostnej spektrometrie (QQQ) s použitím autentických štandardov metabolitov.Demografické charakteristiky cieľovej vzorky metabolomickej štúdie sú zahrnuté v doplnkovej tabuľke 4. V súlade s našimi globálnymi výsledkami metabolomiky kvantitatívna analýza potvrdila, že hypoxantín a xantín, pyruvát a laktát boli zvýšené v LA v porovnaní s BN a HC (obr. 5b, c, p < 0,05).Medzi BN a HC sa však nezistili žiadne významné rozdiely v týchto metabolitoch.
Analýza obohatenia KEGG dráhy výrazne odlišných metabolitov v skupine LA v porovnaní so skupinami BN a HC.Použil sa obojstranný Globaltest a hodnoty p sa upravili pomocou Holm-Bonferroniho metódy (upravené p ≤ 0,001 a veľkosť účinku > 0,01).b–d Husľové grafy zobrazujúce hladiny hypoxantínu, xantínu, laktátu, pyruvátu a tryptofánu v sére HC, BN a LA stanovené pomocou LC-MS/MS (n = 70 na skupinu).Biele a čierne bodkované čiary označujú medián a kvartil.e Husľový graf zobrazujúci normalizovanú Log2TPM (transkripty na milión) mRNA expresiu SLC7A5 a QPRT v pľúcnom adenokarcinóme (n = 513) v porovnaní s normálnym pľúcnym tkanivom (n = 59) v súbore údajov LUAD-TCGA.Biely rámček predstavuje medzikvartilový rozsah, horizontálna čierna čiara v strede predstavuje medián a vertikálna čierna čiara vybiehajúca z rámčeka predstavuje 95 % interval spoľahlivosti (CI).f Pearsonov korelačný graf expresie SLC7A5 a GAPDH v pľúcnom adenokarcinóme (n = 513) a normálnom pľúcnom tkanive (n = 59) v súbore údajov TCGA.Sivá oblasť predstavuje 95 % CI.r, Pearsonov korelačný koeficient.g Normalizované bunkové hladiny tryptofánu v bunkách A549 transfekovaných nešpecifickou kontrolou shRNA (NC) a shSLC7A5 (Sh1, Sh2) stanovené pomocou LC-MS/MS.Uvádza sa štatistická analýza piatich biologicky nezávislých vzoriek v každej skupine.h Bunkové hladiny NADt (celkový NAD, vrátane NAD+ a NADH) v bunkách A549 (NC) a SLC7A5 knockdown bunkách A549 (Sh1, Sh2).Uvádza sa štatistická analýza troch biologicky nezávislých vzoriek v každej skupine.i Glykolytická aktivita buniek A549 pred a po knockdown SLC7A5 bola meraná rýchlosťou extracelulárnej acidifikácie (ECAR) (n = 4 biologicky nezávislé vzorky na skupinu).2-DG,2-deoxy-D-glukóza.V (b–h) bol použitý obojstranný Studentov t test.V (g–i) chybové stĺpce predstavujú priemer ± SD, každý experiment sa uskutočnil trikrát nezávisle a výsledky boli podobné.Zdrojové dáta sú poskytované vo forme zdrojových dátových súborov.
Vzhľadom na významný vplyv zmeneného metabolizmu tryptofánu v skupine LA sme tiež hodnotili hladiny tryptofánu v sére v skupinách HC, BN a LA pomocou QQQ.Zistili sme, že sérový tryptofán bol znížený v LA v porovnaní s HC alebo BN (p < 0,001, obrázok 5d), čo je v súlade s predchádzajúcimi zisteniami, že hladiny cirkulujúceho tryptofánu sú nižšie u pacientov s rakovinou pľúc ako u zdravých kontrol z kontrolnej skupiny33,34 ,35.Ďalšia štúdia s použitím PET/CT indikátora 11C-metyl-L-tryptofánu zistila, že retenčný čas tryptofánového signálu v tkanive rakoviny pľúc sa výrazne zvýšil v porovnaní s benígnymi léziami alebo normálnym tkanivom36.Predpokladáme, že pokles tryptofánu v LA sére môže odrážať aktívne vychytávanie tryptofánu bunkami rakoviny pľúc.
Je tiež známe, že konečným produktom kynurenínovej dráhy katabolizmu tryptofánu je NAD+37,38, ktorý je dôležitým substrátom pre reakciu glyceraldehyd-3-fosfátu s 1,3-bisfosfoglycerátom pri glykolýze39.Zatiaľ čo predchádzajúce štúdie sa zamerali na úlohu katabolizmu tryptofánu v imunitnej regulácii, snažili sme sa objasniť súhru medzi dysreguláciou tryptofánu a glykolytickými dráhami pozorovanými v súčasnej štúdii.Rodina transportérov rozpustených látok 7 člen 5 (SLC7A5) je známy ako tryptofánový transportér43,44,45.Fosforibozyltransferáza kyseliny chinolínovej (QPRT) je enzým umiestnený v smere kynurenínovej dráhy, ktorá premieňa kyselinu chinolínovú na NAMN46.Inšpekcia súboru údajov LUAD TCGA odhalila, že tak SLC7A5, ako aj QPRT boli významne upregulované v nádorovom tkanive v porovnaní s normálnym tkanivom (obr. 5e).Toto zvýšenie sa pozorovalo v štádiách I a II, ako aj v štádiách III a IV adenokarcinómu pľúc (doplnkový obrázok 11), čo naznačuje skoré poruchy metabolizmu tryptofánu spojené s tumorigenézou.
Okrem toho súbor údajov LUAD-TCGA ukázal pozitívnu koreláciu medzi expresiou mRNA SLC7A5 a GAPDH vo vzorkách pacientov s rakovinou (r = 0,45, p = 1,55E-26, obrázok 5f).Na rozdiel od toho sa nezistila žiadna významná korelácia medzi takýmito génovými podpismi v normálnom pľúcnom tkanive (r = 0,25, p = 0,06, obrázok 5f).Knockdown SLC7A5 (doplnkový obrázok 12) v bunkách A549 významne znížil hladiny bunkového tryptofánu a NAD (H) (obrázok 5g, h), čo viedlo k zoslabenej glykolytickej aktivite meranej rýchlosťou extracelulárnej acidifikácie (ECAR) (obrázok 1).5i).Na základe metabolických zmien v sére a detekcie in vitro teda predpokladáme, že metabolizmus tryptofánu môže produkovať NAD+ prostredníctvom kynurenínovej dráhy a zohrávať dôležitú úlohu pri podpore glykolýzy pri rakovine pľúc.
Štúdie ukázali, že veľký počet neurčitých pľúcnych uzlín zistených pomocou LDCT môže viesť k potrebe dodatočného testovania, ako je PET-CT, pľúcna biopsia a nadmerná liečba kvôli falošne pozitívnej diagnóze malignity.31 Ako je znázornené na obrázku 6, naša štúdia identifikovala panel sérových metabolitov s potenciálnou diagnostickou hodnotou, ktoré môžu zlepšiť stratifikáciu rizika a následnú liečbu pľúcnych uzlín zistených pomocou CT.
Pľúcne uzliny sa hodnotia pomocou počítačovej tomografie s nízkou dávkou (LDCT) so zobrazovacími znakmi naznačujúcimi benígne alebo malígne príčiny.Neistý výsledok uzlov môže viesť k častým kontrolným návštevám, zbytočným zásahom a nadmernej liečbe.Zahrnutie sérových metabolických klasifikátorov s diagnostickou hodnotou môže zlepšiť hodnotenie rizika a následnú liečbu pľúcnych uzlín.PET pozitrónová emisná tomografia.
Údaje z americkej štúdie NLST a európskej štúdie NELSON naznačujú, že skríning vysokorizikových skupín pomocou nízkodávkovej počítačovej tomografie (LDCT) môže znížiť úmrtnosť na rakovinu pľúc1,3.Najnáročnejšie však zostáva hodnotenie rizika a následná klinická liečba veľkého počtu náhodných pľúcnych uzlín zistených pomocou LDCT.Hlavným cieľom je optimalizovať správnu klasifikáciu existujúcich protokolov založených na LDCT začlenením spoľahlivých biomarkerov.
Určité molekulárne biomarkery, ako sú krvné metabolity, boli identifikované porovnaním rakoviny pľúc so zdravými kontrolami15,17.V súčasnej štúdii sme sa zamerali na aplikáciu sérovej metabolomickej analýzy na rozlíšenie medzi benígnymi a malígnymi pľúcnymi uzlinami náhodne detegovanými pomocou LDCT.Porovnali sme globálny sérový metabolóm zdravých kontrolných vzoriek (HC), benígnych pľúcnych uzlín (BN) a vzoriek pľúcneho adenokarcinómu v štádiu I (LA) pomocou analýzy UPLC-HRMS.Zistili sme, že HC a BN mali podobné metabolické profily, zatiaľ čo LA vykazovala významné zmeny v porovnaní s HC a BN.Identifikovali sme dve sady sérových metabolitov, ktoré odlišujú LA od HC a BN.
Súčasná schéma identifikácie benígnych a malígnych uzlín založená na LDCT je založená najmä na veľkosti, hustote, morfológii a rýchlosti rastu uzlín v priebehu času30.Predchádzajúce štúdie ukázali, že veľkosť uzlín úzko súvisí s pravdepodobnosťou rakoviny pľúc.Aj u vysokorizikových pacientov je riziko malignity v uzlinách < 6 mm < 1 %.Riziko malignity pre uzliny s veľkosťou 6 až 20 mm sa pohybuje od 8 % do 64 %30.Preto Fleischnerova spoločnosť odporúča hraničný priemer 6 mm na rutinné sledovanie CT.29 Hodnotenie rizika a liečba neurčitých pľúcnych uzlín (IPN) väčších ako 6 mm sa však nevykonali adekvátne31.Súčasný manažment vrodenej srdcovej choroby je zvyčajne založený na bdelom čakaní s častým CT monitorovaním.
Na základe overeného metabolómu sme prvýkrát preukázali prekrytie metabolomických podpisov medzi zdravými jedincami a benígnymi uzlinami < 6 mm.Biologická podobnosť je v súlade s predchádzajúcimi nálezmi CT, že riziko malignity pre uzliny <6 mm je také nízke ako pre subjekty bez uzlín.30 Treba poznamenať, že naše výsledky tiež ukazujú, že benígne uzliny <6 mm a ≥6 mm majú vysoké podobnosť v metabolomických profiloch, čo naznačuje, že funkčná definícia benígnej etiológie je konzistentná bez ohľadu na veľkosť uzla.Moderné panely diagnostických sérových metabolitov teda môžu poskytnúť jediný test ako vylučovací test, keď sa uzliny na začiatku detegujú na CT a potenciálne znižujú sériové monitorovanie.Ten istý panel metabolických biomarkerov zároveň rozlíšil malígne uzliny s veľkosťou ≥ 6 mm od benígnych uzlín a poskytol presné predpovede pre IPN podobnej veľkosti a nejednoznačné morfologické znaky na CT obrazoch.Tento klasifikátor metabolizmu séra fungoval dobre pri predpovedaní malignity uzlín ≥6 mm s AUC 0,927.Celkovo naše výsledky naznačujú, že jedinečné sérové metabolomické podpisy môžu špecificky odrážať skoré metabolické zmeny vyvolané nádorom a majú potenciálnu hodnotu ako prediktory rizika, nezávisle od veľkosti uzlín.
Najmä pľúcny adenokarcinóm (LUAD) a spinocelulárny karcinóm (LUSC) sú hlavnými typmi nemalobunkového karcinómu pľúc (NSCLC).Vzhľadom na to, že LUSC je silne spojená s užívaním tabaku47 a LUAD je najbežnejšou histológiou náhodných pľúcnych uzlín detegovaných pri CT skríningu48, náš model klasifikácie bol špeciálne vytvorený pre vzorky adenokarcinómu štádia I.Wang a kolegovia sa tiež zamerali na LUAD a identifikovali deväť lipidových podpisov pomocou lipidomiky na rozlíšenie rakoviny pľúc v počiatočnom štádiu od zdravých jedincov17.Testovali sme súčasný model klasifikátora na 16 prípadoch štádia I LUSC a 74 benígnych uzloch a pozorovali sme nízku presnosť predikcie LUSC (AUC 0,776), čo naznačuje, že LUAD a LUSC môžu mať svoje vlastné metabolomické podpisy.V skutočnosti sa ukázalo, že LUAD a LUSC sa líšia v etiológii, biologickom pôvode a genetických aberáciách49.Preto by sa do tréningových modelov na populačnú detekciu rakoviny pľúc v skríningových programoch mali zahrnúť iné typy histológie.
Tu sme identifikovali šesť najčastejšie zmenených dráh v pľúcnom adenokarcinóme v porovnaní so zdravými kontrolami a benígnymi uzlinami.Xantín a hypoxantín sú bežné metabolity purínovej metabolickej dráhy.V súlade s našimi výsledkami boli medziprodukty spojené s metabolizmom purínov významne zvýšené v sére alebo tkanivách pacientov s pľúcnym adenokarcinómom v porovnaní so zdravými kontrolami alebo pacientmi v preinvazívnom štádiu15, 50.Zvýšené hladiny xantínu a hypoxantínu v sére môžu odrážať anabolizmus vyžadovaný rýchlo proliferujúcimi rakovinovými bunkami.Dysregulácia metabolizmu glukózy je dobre známym znakom metabolizmu rakoviny51.Tu sme pozorovali významné zvýšenie pyruvátu a laktátu v skupine LA v porovnaní so skupinou HC a BN, čo je v súlade s predchádzajúcimi správami o abnormalitách glykolytických dráh v profiloch sérového metabolómu pacientov s nemalobunkovým karcinómom pľúc (NSCLC) a zdravé kontroly.výsledky sú konzistentné52,53.
Dôležité je, že sme pozorovali inverznú koreláciu medzi metabolizmom pyruvátu a tryptofánu v sére pľúcnych adenokarcinómov.Hladiny tryptofánu v sére boli znížené v skupine LA v porovnaní so skupinou HC alebo BN.Je zaujímavé, že predchádzajúca rozsiahla štúdia využívajúca prospektívnu kohortu zistila, že nízke hladiny cirkulujúceho tryptofánu boli spojené so zvýšeným rizikom rakoviny pľúc 54 .Tryptofán je esenciálna aminokyselina, ktorú získavame výlučne z potravy.Dospeli sme k záveru, že deplécia tryptofánu v sére pri pľúcnom adenokarcinóme môže odrážať rýchlu depléciu tohto metabolitu.Je dobre známe, že konečný produkt katabolizmu tryptofánu prostredníctvom kynurenínovej dráhy je zdrojom de novo syntézy NAD+.Pretože NAD+ je produkovaný predovšetkým cestou záchrany, význam NAD+ v metabolizme tryptofánu pre zdravie a chorobu je potrebné určiť46.Naša analýza databázy TCGA ukázala, že expresia transportéra rozpustenej látky tryptofánového transportéra 7A5 (SLC7A5) bola významne zvýšená pri pľúcnom adenokarcinóme v porovnaní s normálnymi kontrolami a pozitívne korelovala s expresiou glykolytického enzýmu GAPDH.Predchádzajúce štúdie sa zameriavali hlavne na úlohu katabolizmu tryptofánu pri potlačovaní protinádorovej imunitnej odpovede40,41,42.Tu demonštrujeme, že inhibícia vychytávania tryptofánu knockdownom SLC7A5 v bunkách rakoviny pľúc vedie k následnému zníženiu bunkových hladín NAD a súčasnému zoslabeniu glykolytickej aktivity.Stručne povedané, naša štúdia poskytuje biologický základ pre zmeny v sérovom metabolizme spojených s malígnou transformáciou pľúcneho adenokarcinómu.
Mutácie EGFR sú najčastejšími riadiacimi mutáciami u pacientov s NSCLC.V našej štúdii sme zistili, že pacienti s mutáciou EGFR (n = 41) mali celkové metabolomické profily podobné pacientom s divokým typom EGFR (n = 31), hoci u pacientov s acylkarnitínom sme zistili znížené sérové hladiny niektorých pacientov s mutantom EGFR.Stanovenou funkciou acylkarnitínov je transport acylových skupín z cytoplazmy do mitochondriálnej matrice, čo vedie k oxidácii mastných kyselín na produkciu energie 55 .V súlade s našimi zisteniami nedávna štúdia tiež identifikovala podobné profily metabolómov medzi mutantmi EGFR a nádormi divokého typu EGFR analýzou globálneho metabolómu 102 vzoriek tkaniva pľúcneho adenokarcinómu50.Je zaujímavé, že obsah acylkarnitínu sa zistil aj v skupine mutantov EGFR.Či zmeny hladín acylkarnitínu odrážajú metabolické zmeny vyvolané EGFR a základné molekulárne dráhy, si preto môže zaslúžiť ďalšiu štúdiu.
Na záver, naša štúdia stanovuje sérový metabolický klasifikátor na diferenciálnu diagnostiku pľúcnych uzlín a navrhuje pracovný postup, ktorý môže optimalizovať hodnotenie rizika a uľahčiť klinický manažment na základe skríningu CT.
Túto štúdiu schválila Etická komisia Univerzitnej nemocnice pre rakovinu Sun Yat-sen, Prvá pridružená nemocnica Univerzity Sun Yat-sen a Etická komisia Univerzitnej nemocnice pre rakovinu Zhengzhou.V skupinách objavovania a internej validácie bolo odobraných 174 sér od zdravých jedincov a 244 sér z benígnych uzlín od jedincov, ktorí sa každoročne podrobili lekárskym vyšetreniam na Oddelení kontroly a prevencie rakoviny, Sun Yat-sen University Cancer Center a 166 benígnych uzlín.sérum.Pľúcne adenokarcinómy štádia I boli odobraté zo Sun Yat-sen University Cancer Center.V externej validačnej kohorte bolo 48 prípadov benígnych uzlín, 39 prípadov adenokarcinómu pľúc I. štádia z First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University a 24 prípadov I. štádia adenokarcinómu pľúc z nemocnice Zhengzhou Cancer Hospital.Centrum pre rakovinu Sun Yat-sen University tiež zhromaždilo 16 prípadov skvamocelulárneho karcinómu pľúc v štádiu I na testovanie diagnostickej schopnosti zavedeného metabolického klasifikátora (charakteristiky pacienta sú uvedené v doplnkovej tabuľke 5).Vzorky z kohorty zisťovania a internej validačnej kohorty sa zbierali medzi januárom 2018 a májom 2020. Vzorky pre externú validačnú kohortu sa zbierali medzi augustom 2021 a októbrom 2022. Aby sa minimalizovala rodová zaujatosť, ku každému bol priradený približne rovnaký počet prípadov mužov a žien kohorta.Discovery Team a Interný kontrolný tím.Pohlavie účastníka bolo určené na základe sebahodnotenia.Od všetkých účastníkov bol získaný informovaný súhlas a nebola poskytnutá žiadna kompenzácia.Jedinci s benígnymi uzlinami boli tí, ktorí mali stabilné skóre CT skenovania po 2 až 5 rokoch v čase analýzy, s výnimkou 1 prípadu z externej validačnej vzorky, ktorá bola odobratá pred operáciou a diagnostikovaná histopatológiou.S výnimkou chronickej bronchitídy.Prípady adenokarcinómu pľúc boli zhromaždené pred resekciou pľúc a potvrdené patologickou diagnózou.Vzorky krvi nalačno sa odoberali do skúmaviek na separáciu séra bez akýchkoľvek antikoagulancií.Vzorky krvi sa zrážali počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a potom sa centrifugovali pri 2851 x g počas 10 minút pri 4 °C, aby sa zozbieral sérový supernatant.Sérové alikvóty boli zmrazené pri -80 °C až do extrakcie metabolitu.Oddelenie prevencie rakoviny a lekárskeho vyšetrenia Centra pre rakovinu univerzity Sun Yat-sen zozbieralo zásobu séra od 100 zdravých darcov, vrátane rovnakého počtu mužov a žien vo veku 40 až 55 rokov.Zmiešali sa rovnaké objemy každej vzorky darcu, výsledná zásoba sa rozdelila na alikvóty a skladovala sa pri -80 °C.Zmes séra sa použila ako referenčný materiál na kontrolu kvality a štandardizáciu údajov.
Referenčné sérum a testované vzorky boli rozmrazené a metabolity boli extrahované použitím kombinovanej extrakčnej metódy (MTBE/metanol/voda)56.Stručne, 50 μl séra sa zmiešalo s 225 μl ľadovo studeného metanolu a 750 μl ľadovo studeného metyl-terc-butyléteru (MTBE).Zmes sa mieša a inkubuje sa na ľade počas 1 hodiny.Vzorky sa potom zmiešali a na vortexe sa zmiešali so 188 μl vody MS s obsahom vnútorných štandardov (13C-laktát, 13C3-pyruvát, 13C-metionín a 13C6-izoleucín, zakúpené od Cambridge Isotope Laboratories).Zmes sa potom centrifugovala pri 15 000 x g počas 10 minút pri 4 ° C a spodná fáza sa preniesla do dvoch skúmaviek (125 ul každá) na analýzu LC-MS v pozitívnom a negatívnom režime.Nakoniec sa vzorka odparila do sucha vo vysokorýchlostnom vákuovom koncentrátore.
Vysušené metabolity sa rekonštituovali v 120 μl 80 % acetonitrilu, pretrepávali sa 5 minút a centrifugovali pri 15 000 x g počas 10 minút pri 4 °C.Supernatanty sa preniesli do ampuliek z jantárového skla s mikrovložkami na štúdie metabolomiky.Necielená metabolomická analýza na platforme ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie s vysokým rozlíšením hmotnostnej spektrometrie (UPLC-HRMS).Metabolity sa separovali pomocou systému Dionex Ultimate 3000 UPLC a kolóny ACQUITY BEH Amide (2,1 x 100 mm, 1,7 μm, Waters).V režime kladných iónov boli mobilné fázy 95 % (A) a 50 % acetonitril (B), pričom každá obsahovala 10 mmol/l octanu amónneho a 0,1 % kyseliny mravčej.V negatívnom režime mobilné fázy A a B obsahovali 95 % a 50 % acetonitrilu, obe fázy obsahovali 10 mmol/l octanu amónneho, pH = 9. Gradientový program bol nasledovný: 0–0,5 min, 2 % B;0,5–12 min, 2–50 % B;12 – 14 min, 50 – 98 % B;14–16 min, 98 % B;16-16.1.min, 98-2 % B;16,1–20 min, 2 % B. Kolóna sa udržiavala pri 40 °C a vzorka pri 10 °C v automatickom vzorkovači.Prietok bol 0,3 ml/min, vstrekovaný objem bol 3 μl.Hmotnostný spektrometer Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) so zdrojom elektrosprejovej ionizácie (ESI) bol prevádzkovaný v režime úplného skenovania a spojený s režimom monitorovania ddMS2 na zber veľkých objemov údajov.Parametre MS boli nastavené nasledovne: rozprašovacie napätie +3,8 kV/- 3,2 kV, teplota kapiláry 320 °C, ochranný plyn 40 arb, pomocný plyn 10 arb, teplota ohrievača sondy 350 °C, rozsah snímania 70–1050 m/h, rozhodnutie.70 000. Údaje boli získané pomocou Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Na posúdenie kvality údajov sa vytvorili vzorky na kontrolu kvality (QC) odstránením 10 ul alikvótov supernatantu z každej vzorky.Na začiatku analytickej sekvencie sa analyzovalo šesť vstreknutí vzorky na kontrolu kvality, aby sa vyhodnotila stabilita systému UPLC-MS.Vzorky na kontrolu kvality sa potom pravidelne zavádzajú do šarže.Všetkých 11 šarží vzoriek séra v tejto štúdii sa analyzovalo pomocou LC-MS.Alikvóty zmesi sérového poolu od 100 zdravých darcov sa použili ako referenčný materiál v príslušných dávkach na monitorovanie extrakčného procesu a prispôsobenie sa účinkom medzi jednotlivými dávkami.Necielená metabolomická analýza kohorty objavu, kohorty internej validácie a kohorty externej validácie sa uskutočnila v Metabolomickom centre Sun Yat-sen University.Externé laboratórium Technologického analytického a testovacieho centra Guangdong University tiež analyzovalo 40 vzoriek z externej kohorty na testovanie výkonnosti modelu klasifikátora.
Po extrakcii a rekonštitúcii sa merala absolútna kvantifikácia sérových metabolitov pomocou ultra vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie-tandemovej hmotnostnej spektrometrie (Agilent 6495 trojitý kvadrupól) so zdrojom elektrosprejovej ionizácie (ESI) v režime monitorovania viacerých reakcií (MRM).Na oddelenie metabolitov sa použila kolóna ACQUITY BEH Amide (2,1 x 100 mm, 1,7 μm, Waters).Mobilná fáza pozostávala z 90 % (A) a 5 % acetonitrilu (B) s 10 mmol/l octanu amónneho a 0,1 % roztoku amoniaku.Gradientový program bol nasledujúci: 0–1,5 min, 0 % B;1,5–6,5 min, 0–15 % B;6,5-8 min, 15% B;8-8,5 min, 15%-0% B;8,5 – 11,5 min, 0 % B.Kolóna sa udržiavala pri 40 °C a vzorka pri 10 °C v automatickom vzorkovači.Prietok bol 0,3 ml/min a vstrekovaný objem bol 1 ul.MS parametre boli nastavené nasledovne: kapilárne napätie ± 3,5 kV, tlak nebulizátora 35 psi, prietok plášťového plynu 12 l/min, teplota plášťového plynu 350 °C, teplota sušiaceho plynu 250 °C a prietok sušiaceho plynu 14 l/min.MRM konverzie tryptofánu, pyruvátu, laktátu, hypoxantínu a xantínu boli 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 a 151,0–107.9 resp.Údaje sa zbierali pomocou Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Pre vzorky séra sa tryptofán, pyruvát, laktát, hypoxantín a xantín kvantifikovali pomocou kalibračných kriviek roztokov štandardných zmesí.Pre vzorky buniek bol obsah tryptofánu normalizovaný na vnútorný štandard a hmotu bunkového proteínu.
Vrcholová extrakcia (m/z a retenčný čas (RT)) sa uskutočnila pomocou Compound Discovery 3.1 a TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Aby sa eliminovali potenciálne rozdiely medzi šaržami, každý charakteristický vrchol testovanej vzorky sa vydelil charakteristickým vrcholom referenčného materiálu z rovnakej šarže, aby sa získala relatívna hojnosť.Relatívne štandardné odchýlky interných štandardov pred a po štandardizácii sú uvedené v doplnkovej tabuľke 6. Rozdiely medzi týmito dvoma skupinami boli charakterizované mierou falošného objavenia (FDR <0,05, Wilcoxonov podpísaný rank test) a násobnou zmenou (>1,2 alebo <0,83).Nespracované MS dáta extrahovaných znakov a MS dáta korigované referenčným sérom sú zobrazené v doplnkových dátach 1 a doplnkových dátach 2, v danom poradí.Anotácia vrcholu sa uskutočnila na základe štyroch definovaných úrovní identifikácie, vrátane identifikovaných metabolitov, údajne anotovaných zlúčenín, predpokladaných charakterizovaných tried zlúčenín a neznámych zlúčenín22.Na základe vyhľadávania v databáze v Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) boli nakoniec vybrané biologické zlúčeniny s MS/MS zodpovedajúcimi overeným štandardom alebo anotáciami presnej zhody v mzCloud (skóre > 85) alebo Chemspider ako medziprodukty medzi diferenciálnym metabolómom.Anotácie vrcholov pre každú funkciu sú zahrnuté v doplnkových údajoch 3. MetaboAnalyst 5.0 sa použil na jednorozmernú analýzu množstva normalizovaných metabolitov.MetaboAnalyst 5.0 tiež vyhodnotil analýzu obohatenia dráhy KEGG na základe výrazne odlišných metabolitov.Analýza hlavných komponentov (PCA) a čiastočná diskriminačná analýza najmenších štvorcov (PLS-DA) sa analyzovali pomocou softvérového balíka ropls (v.1.26.4) s normalizáciou zásobníka a automatickým škálovaním.Optimálny model biomarkerov metabolitu na predpovedanie malignity uzliny bol vytvorený pomocou binárnej logistickej regresie s najmenším absolútnym zmršťovaním a výberovým operátorom (LASSO, R balík v.4.1-3).Výkonnosť diskriminačného modelu v súboroch detekcie a validácie bola charakterizovaná odhadom AUC na základe ROC analýzy podľa balíka pROC (v.1.18.0.).Optimálna hranica pravdepodobnosti bola získaná na základe maximálneho Youdenovho indexu modelu (senzitivita + špecificita – 1).Vzorky s hodnotami nižšími alebo väčšími ako prah budú predpovedané ako benígne uzliny a pľúcny adenokarcinóm.
Bunky A549 (č. CCL-185, American Type Culture Collection) sa pestovali v médiu F-12K obsahujúcom 10 % FBS.Krátke vlásenkové RNA (shRNA) sekvencie zacielené na SLC7A5 a necielenú kontrolu (NC) boli vložené do lentivírusového vektora pLKO.1-puro.Antisense sekvencie shSLC7A5 sú nasledovné: Shl (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Protilátky proti SLC7A5 (č. 5347) a tubulín (č. 2148) boli zakúpené od spoločnosti Cell Signaling Technology.Protilátky proti SLC7A5 a tubulín sa použili v riedení 1:1000 na analýzu Western blot.
Glykolytický stresový test Seahorse XF meria hladiny extracelulárnej acidifikácie (ECAR).V teste sa glukóza, oligomycín A a 2-DG podávali sekvenčne na testovanie bunkovej glykolytickej kapacity meranej pomocou ECAR.
Bunky A549 transfekované necielenou kontrolou (NC) a shSLC7A5 (Sh1, Sh2) sa cez noc umiestnili na misky s priemerom 10 cm.Bunkové metabolity sa extrahovali 1 ml ľadovo studeného 80 % vodného metanolu.Bunky v metanolovom roztoku boli zoškrabané, zozbierané do novej skúmavky a centrifugované pri 15 000 x g počas 15 minút pri 4 °C.Odoberte 800 µl supernatantu a vysušte pomocou vysokorýchlostného vákuového koncentrátora.Vysušené pelety metabolitov sa potom analyzovali na hladiny tryptofánu pomocou LC-MS/MS, ako je opísané vyššie.Bunkové hladiny NAD(H) v bunkách A549 (NC a shSLC7A5) sa merali pomocou kvantitatívnej kolorimetrickej súpravy NAD+/NADH (#K337, BioVision) podľa pokynov výrobcu.Hladiny proteínov sa merali pre každú vzorku, aby sa normalizovalo množstvo metabolitov.
Na predbežné určenie veľkosti vzorky neboli použité žiadne štatistické metódy.Predchádzajúce metabolomické štúdie zamerané na objavenie biomarkerov15,18 sa považovali za referenčné hodnoty na určenie veľkosti a v porovnaní s týmito správami bola naša vzorka primeraná.Zo študijnej kohorty neboli vylúčené žiadne vzorky.Vzorky séra boli náhodne priradené k objaviteľskej skupine (306 prípadov, 74,6 %) a internej validačnej skupine (104 prípadov, 25,4 %) pre necielené metabolomické štúdie.Tiež sme náhodne vybrali 70 prípadov z každej skupiny zo súboru objavov pre cielené metabolomické štúdie.Počas zberu a analýzy údajov LC-MS boli vyšetrovatelia zaslepení pri prideľovaní skupín.Štatistické analýzy metabolomických údajov a bunkové experimenty sú opísané v príslušných častiach Výsledky, Legendy obrázkov a Metódy.Kvantifikácia bunkového tryptofánu, NADT a glykolytickej aktivity sa uskutočnila trikrát nezávisle s rovnakými výsledkami.
Ďalšie informácie o dizajne štúdie nájdete v abstrakte správy o prirodzenom portfóliu spojenom s týmto článkom.
Nespracované MS dáta extrahovaných znakov a normalizované MS dáta referenčného séra sú zobrazené v doplnkových dátach 1 a doplnkových dátach 2, v danom poradí.Špičkové anotácie pre diferenciálne funkcie sú uvedené v doplnkových údajoch 3. Súbor údajov LUAD TCGA si môžete stiahnuť z https://portal.gdc.cancer.gov/.Vstupné údaje pre vykreslenie grafu sú uvedené v zdrojových údajoch.Zdrojové údaje sú poskytnuté pre tento článok.
Národná študijná skupina pre skríning pľúc atď. Zníženie úmrtnosti na rakovinu pľúc pomocou počítačovej tomografie s nízkymi dávkami.Severné Anglicko.J. Med.365, 395 – 409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR a Prophet, PC Skríning rakoviny pľúc pomocou nízkodávkového helikálneho CT: výsledky z Národnej skríningovej štúdie pľúc (NLST).J. Med.Obrazovka 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, a kol.Zníženie úmrtnosti na rakovinu pľúc pomocou volumetrického CT skríningu v randomizovanej štúdii.Severné Anglicko.J. Med.382, 503 – 513 (2020).
Čas odoslania: 18. september 2023