CRISPR (klastrované pravidelne rozmiestnené krátke palindromické opakovania) je technika editácie genómu tretej generácie, ktorá vďaka svojim vysoko výkonným výsledkom spôsobila revolúciu vo svete. Používa sa na liečbu rôznych biologických ochorení a infekcií. Rôzne baktérie a iné prokaryoty (ako napríklad archea) majú tiež systémy CRISPR/Cas9 na obranu proti fágom. Bolo hlásené, že stratégie založené na CRISPR/Cas9 môžu inhibovať rast a progresiu trojito negatívneho karcinómu prsníka (TNBC) zacielením na potenciálne zmenené gény rezistencie, transkripciu a epigenetickú reguláciu. Tieto terapeutické intervencie môžu pomôcť riešiť náročné problémy, ako je rezistencia na lieky pozorovaná aj pri TNBC. V súčasnosti sa na dodávanie CRISPR/Cas9 do cieľových buniek používajú rôzne metódy, ako sú fyzikálne (mikroinjekcia, elektroporácia a hydrodynamické režimy), vírusové (adeno-asociovaný vírus a lentivírus) a nevírusové (lipozómy a lipidové nanočastice). Hoci bolo vyvinutých niekoľko modelov na štúdium molekulárnych príčin TNBC, nedostatok citlivých a cielených metód na poskytovanie nástrojov na úpravu genómu in vivo obmedzuje ich klinické využitie. Stručne povedané, táto recenzia komplexne skúma pokrok, výzvy, obmedzenia a perspektívy liečby TNBC pomocou CRISPR/Cas9 na základe existujúcich dôkazov. Zdôrazňujeme tiež, ako môže kombinácia umelej inteligencie a strojového učenia zlepšiť stratégie CRISPR/Cas9 pri liečbe TNBC.
Rakovina sa vyznačuje nekontrolovaným delením buniek, narušením kontrolných bodov bunkového cyklu a mutáciami v génoch potláčajúcich nádory (TSG) (Matthews a kol., 2022). Spomedzi rôznych typov rakoviny je rakovina prsníka najčastejším typom rakoviny u žien a má vysokú mieru úmrtnosti na celom svete (Waks a Winer, 2019). Rakovina prsníka je heterogénne ochorenie s rôznymi charakteristikami, ako sú histologické a biologické znaky, klinický obraz a správanie a odpoveď na liečbu (Weigelt a kol., 2010). Klasifikácia rakoviny prsníka poskytuje presné poznatky o diagnostike rakoviny prsníka a prognóze nádoru. Použitie bežných biomarkerov a klinicko-patologických znakov bolo hlavným kritériom pre klasifikáciu rakoviny prsníka (Tsang a Tse, 2019). Prognózu a odpoveď na liečbu rakoviny prsníka ovplyvňuje množstvo faktorov vrátane prítomnosti estrogénového receptora (ER), progesterónového receptora (PR), receptora 2 ľudského epidermálneho rastového faktora (HER2/neu) a histologického stupňa, typu a stupňa nádoru, veľkosti a metastáz do lymfatických uzlín (Al-Tubaiti, 2020). Bolo identifikovaných päť vnútorných molekulárnych podtypov rakoviny prsníka, vrátane luminálneho A, luminálneho B, HER2-obohateného, bazalného a s nízkym obsahom klaudínu (Prat a kol., 2015). TNBC je molekulárny podtyp rakoviny, ktorý neexprimuje všetky ER, PR a HER2 (Yin a kol., 2020). Tieto patologické znaky sú spojené s TNBC, čo potvrdzuje jeho rýchlu progresiu a agresívnejšiu povahu ako akýkoľvek iný typ rakoviny prsníka (Feng a kol., 2018). Okrem toho Peru a kol. (2000) použili technológiu mikročipov na reklasifikáciu rakoviny prsníka a identifikáciu piatich vnútorných podtypov rakoviny prsníka (Cadenas, 2012). Bazálny karcinóm prsníka je podtyp rakoviny prsníka, ktorý má trojito negatívny fenotyp a je spojený s rýchlou progresiou. Treba poznamenať, že všetky bazálne podobné karcinómy prsníka sú bežne chybne diagnostikované ako TNBC, ale iba 77 % z nich sú TNBC; Naproti tomu 71 – 91 % TNBC má bazálny tvar, čo naznačuje, že tieto dva typy rakoviny prsníka sa prekrývajú a predstavujú rôzne klasifikácie (Wang D.-Y. a kol., 2019). To vytvára potrebu charakterizovať heterogenitu TNBC s cieľom objasniť prognózu a identifikovať potenciálne odpovede na súčasnú a budúcu liečbu. Okrem toho TNBC predstavuje 15 – 20 % všetkých prípadov rakoviny prsníka a je častejší u žien mladších ako 50 rokov. Mutácie BRCA1 alebo BRCA2 boli hlásené približne v 20 % prípadov TNBC (Xie a kol., 2017; Tzikas a kol., 2017). Štúdie tiež ukázali, že TNBC má odlišné imunitné mikroprostredie, ktoré zahŕňa vysoké hladiny vaskulárnych endotelových rastových faktorov, makrofágov asociovaných s nádorom (TAM), lymfocytov infiltrujúcich nádor (TIL) a ďalších molekúl zapojených do rastu a migrácie nádoru. Preto je pochopenie mikroprostredia TNBC kľúčové pre jej prognózu a liečbu (Fan a He, 2022).
Na posúdenie prognózy TNBC a zabezpečenie účinnej liečby je dôležitá presná diagnóza, založená najmä na imunohistochémii (IHC) na detekciu ER, PR a HER2 a mamografii na detekciu neoplázií prsníka. Mamografia však nedokáže adekvátne zobraziť intratumorálne znaky, ako je nekróza a fibróza (Deepak Singh a kol., 2021). Keďže zlá prognóza a diagnóza bránia lekárom v predpisovaní správnych liekov (Chaudhary, 2020), na zlepšenie starostlivosti o pacientky s TNBC sa používajú rôzne stratégie. V súčasnosti sa u pacientok s TNBC používajú dva lieky, doxorubicín a cyklofosfamid, ktoré preukázali dobré výsledky. Okrem toho sa používajú aj iné platinové lieky, ako je karboplatina a cisplatina (Sikov a kol., 2015). Okrem toho sa ako potenciálne chemoterapeutické lieky na liečbu TNBC používajú inhibítory PARP, ako sú Olaparib, Velaparib a PF-01367338 (Ishino a kol., 2018). Keďže sa uvádza, že signálne dráhy Wnt/b-katenín, NOTCH a Hedgehog sa podieľajú na výskyte a progresii TNBC, zameranie liekov na tieto dráhy môže byť dôležitou stratégiou (Aysola a kol., 2013). Hoci chirurgický zákrok, rádioterapia a chemoterapia zostávajú v súčasnosti hlavným pilierom liečby TNBC, dosiahol sa významný pokrok vo vývoji nových liečebných postupov vrátane cielenej terapie, imunoterapie, rôznych nástrojov na génovú úpravu súvisiacich s CRISPR, ako sú Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editácia a génová terapia zameraná na CRISPR/Cas9. V tejto časti sa zameriame na rôzne nástroje na génovú úpravu súvisiace s CRISPR používané pri liečbe TNBC. Medzi nimi si CRISPR/Cas9 získal širokú pozornosť.
Cas9n, tiež známy ako Cas9 nikáza, je geneticky modifikovaný variant proteínu Cas9 odvodený zo systému editácie genómu CRISPR/Cas9 (Gupta a kol., 2019). Vo svojej pôvodnej forme proteín Cas9 obsahuje dve nukleázové domény: RuvC a HNH, ktorých hlavnou funkciou je štiepenie oboch vlákien DNA. V Cas9n je však jedna z nukleázových domén, HNH, geneticky mutovaná a stáva sa neaktívnou. Preto doména HNH v Cas9n zostáva nefunkčná. Aktívna zostáva iba doména RuvC, čo umožňuje Cas9n strihať alebo vytvárať zlomy na jednotlivých vláknach DNA (Trevino a Zhang, 2014). V porovnaní s Cas9 dokáže Cas9n účinne redukovať necieliace účinky a presne zlepšovať mechanizmy opravy buniek. Cas9n sa dá použiť na riešenie rôznych problémov, ako je vytváranie zlomov na špecifických miestach v dvojvláknovej DNA. Na tento účel boli dve molekuly Cas9n skombinované a použité spoločne (Yee, 2016). Mixed lineage kináza 3 (MLK3) je mitogénom aktivovaná proteínkináza, ktorá slúži ako kľúčový regulátor počas metastáz TNBC (Cronan a kol., 2012).
MLK3 môže aktivovať viacero signálnych dráh vedúcich k metastázam TNBC. Napríklad dráha c-Jun N-terminálnej kinázy (JNK) reguluje pohyblivosť buniek a degradáciu extracelulárnej matrice a MLK3 aktivuje dráhu JNK, čím zvyšuje pohyblivosť buniek a dodáva im invazívne vlastnosti (Rattanasinchai a Gallo, 2016). MLK3 tiež reguluje EMT. Na tento účel aktivuje transkripčné faktory downstream, ako sú Snail, Slug a Twist. Tieto faktory inhibujú expresiu epitelových markerov a podporujú expresiu mezenchymálnych markerov, čo vedie k získaniu metastatického fenotypu (Casalino a kol., 2023). Bolo pozorované, že MLK3 hrá úlohu v remodelácii ECM a aktivácii proteáz, ako sú matrixové metaloproteinázy (MMP), ktoré degradujú ECM. To uľahčuje inváziu nádorových buniek a ich šírenie do vzdialených miest (Katari a kol., 2019). Predchádzajúce štúdie teda ukázali, že MLK3 hrá kľúčovú úlohu v TNBC. Rattanasinchai a Gallo použili modely TNBC na štúdium úlohy MLK3 a zistili, že podporuje rozvoj rakoviny prostredníctvom špecifických signálnych dráh. Na úpravu MLK3 použili CRISPR/Cas9n a pozorovali významné zníženie metastáz TNBC (Rattanasinchai a Gallo, 2016).
dCas9, často nazývaný inaktívny Cas9, je modifikovaná derivátová forma proteínu Cas9. Na rozdiel od aktívneho Cas9, dCas9 nemá endonukleázovú aktivitu, takže nie je schopný indukovať dvojvláknové zlomy DNA. Preto sa dCas9 môže použiť na presné zacielenie špecifických oblastí genómu bez akýchkoľvek zmien alebo modifikácií sekvencie DNA (Wang a kol., 2016). V dCas9 sú dva endonukleázové proteíny, RuvC a HNH, inaktivované potlačením dôležitých aminokyselinových zvyškov. (Richter a kol., 2016). Napriek tomu, že nemá aktivitu štiepenia DNA, dCas9 hrá množstvo dôležitých úloh v genetickom výskume a biotechnológii. Napríklad umožňuje vizualizáciu špecifických oblastí genómu, uľahčuje transkripčnú reguláciu a podporuje epigenetické modifikácie (Brocken a kol., 2018).
Transkripčný faktor ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) hrá špecifickú a kľúčovú úlohu pri sprostredkovaní epitelovo-mezenchymálneho prechodu (EMT), čo je bunkový proces, ktorý prebieha počas embryonálneho vývoja, opravy tkaniva a progresie rakoviny. Zahŕňa transformáciu epitelových buniek na mezenchymálne bunky, čo vedie k zmenám v morfológii buniek, motilite, invazívnosti atď. (Wu a kol., 2020). ZEB1 inhibuje viacero epitelových markerov, ako je E-kadherín a okludín, ktoré sú zodpovedné za udržiavanie adhézie buniek a polarity epitelových buniek pri TNBC (Moreno-Bueno a kol., 2008). Okrem toho ZEB1 aktivuje určité markery, ako je N-kadherín, vimentín a fibronektín (Konradi a kol., 2014), a tiež reguluje gény zapojené do remodelácie cytoskeletu, ako sú Rho GTPázy a matrixové metaloproteinázy (MMP) (Huang a kol., 2014). 2022), okrem toho ovplyvňuje aj rôzne signálne dráhy, ako je transformujúci rastový faktor β (TGF-β), Wnt signalizácia atď., čím podporuje inváziu a metastázovanie nádoru pri TNBC (Chen a kol., 2016). Početné štúdie a vedecké dôkazy naznačujú, že ZEB1 má veľký potenciál ako cenné činidlo na detekciu a terapeutickú intervenciu TNBC. V nedávnej štúdii Waryah a kol. použili model TNBC a dosiahli úplné potlačenie ZEB1 pomocou dCas9. Pozorovali teda veľmi vysokú špecificitu a takmer úplnú inhibíciu ZEB1 v podmienkach in vivo (Waryah a kol., 2023).
CRISPR/Cas12 je nástroj na editáciu génov s názvom CRISPR/Cpf1. Je odvodený od systému CRISPR/Cas, kde termín Cas12 označuje proteín 12 asociovaný s CRISPR (Bharathkumar a kol., 2022), ktorý je úplne podobný Cas9. Jediný rozdiel je v tom, že obsahuje proteín Cas12. V porovnaní s Cas9 má Cas12 niektoré jedinečné funkcie, ako napríklad generovanie lepkavých koncov počas procesu editácie génov, zatiaľ čo Cas9 generuje tupé konce (Wang a kol., 2021). Táto vlastnosť Cas12 prispieva k jeho špecifickej technológii manipulácie s DNA. Ako proteín schopný presne rozpoznávať a štiepiť cieľovú DNA má mimoriadnu všestrannosť, vďaka čomu je účinným nástrojom pre rôzne aplikácie vrátane editácie génov (Pickar-Oliver a Gersbach, 2019).
Podobne ako iné varianty CRISPR, aj CRISPR/Cas12 je schopný vyradiť alebo aktivovať gény v TNBC, pričom sa zameriava na gény, ktoré hrajú dôležitú úlohu v jeho patogenéze alebo reakcii na liečbu (Yang a Zhang, 2023). Na dosiahnutie tohto procesu bola vyvinutá vodiaca RNA (gRNA), ktorá smeruje Cas12 k cieľovému génu. Keď sa Cas12 naviaže na svoj cieľ, zavedie dvojvláknové zlomy v DNA a aktivuje mechanizmy opravy DNA. Počas procesu opravy môžu byť začlenené nesprávne nukleotidy, čo vedie k génovým mutáciám a strate funkcie (Zhang a kol., 2021a). Okrem toho bola na aktiváciu génov použitá aj vylepšená verzia enzýmu Cas12 (nazývaná dCas12). Jeho kombináciou s transkripčným aktivátorom je možné indukovať určité gény, a tým ich aktivovať. Táto technológia má veľký potenciál pri podpore aktivácie génov supresorov nádorov (Sultan a kol., 2022).
Prime editácia je novovyvinutá a mimoriadne pokročilá technológia editácie genómu. Je schopná veľmi presne modifikovať DNA organizmu (Chen a Liu, 2023). Prime editácia sa dosahuje integráciou dvoch hlavných komponentov: modifikovaného enzýmu CRISPR/Cas9 a reverznej transkriptázy. Úlohou enzýmu CRISPR/Cas9 je selektívne zacieliť na presné miesta v genóme, zatiaľ čo reverzná transkriptáza pomáha dôkladne modifikovať DNA v cieľovom mieste (Hassan a kol., 2021). V mechanizme editácie primerov prvým krokom je vytvorenie vodiacej RNA pre editáciu primerov (pegRNA) (Standage-Beier a kol., 2021). Obsahuje cieľovú sekvenciu a templát RNA zodpovedajúci požadovanému miestu editácie v cieľovej DNA. PegRNA sa potom zavedie do cieľových buniek spolu s nukleázou pre editáciu primerov (PE2). PE2 je fúzny proteín pozostávajúci z enzýmu Cas9, reverznej transkriptázy a adaptéra pre editáciu primerov (Martín-Alonso a kol., 2021). Vo vnútri bunky komplexy pegRNA a PE2 hľadajú špecifickú DNA, ktorú chcú modifikovať. Enzým Cas9 štiepi DNA a vytvára templát pozostávajúci z jednotlivých vlákien (Choi a kol., 2022). Reverzná transkriptáza používa tento templát na prípravu DNA na editáciu. Spolu s kopírovaním DNA sú zahrnuté aj pokyny na editáciu templátu RNA. Nakoniec sa novovytvorený reťazec DNA použije ako templát na opravu zlomu v DNA, čo vedie k zmenenej sekvencii DNA obsahujúcej požadovanú modifikáciu (Ochoa-Sanchez a kol., 2021). Mechanizmy editácie primerov môžu viesť k rozsiahlym mutáciám v génoch. Môžu sa zamerať na bodové mutácie, inzercie, delécie a dokonca aj nahradenie génov (Anzalone a kol., 2019; Chen a Liu, 2023). Primárna editácia ponúka oproti predchádzajúcim technológiám editácie genómu niekoľko výhod. Medzi ne patrí zvýšená presnosť, znížené účinky mimo cieľa a schopnosť editovať DNA bez spoliehania sa na dvojvláknové zlomy DNA (Anzalone a kol., 2020).
Technológia CRISPR/Cas9 bola pôvodne vyvinutá na ochranu baktérií pred prenosom plazmidov a fágovou infekciou a neskôr bola znovu použitá ako účinný nástroj na cielenie DNA na báze RNA pre editáciu genómu (Jiang a Doudna, 2017). Okrem toho sa uvádza, že systém CRISPR/Cas9 je prítomný v 50 % a 87 % bakteriálnych a archaálnych genómov (Ishino a kol., 2018). CRISPR/Cas9 je potenciálny nástroj na deléciu, inzerciu a korekciu akejkoľvek abnormálnej genetickej sekvencie pomocou in vivo a in vitro režimov (Sabit a kol., 2021). Okrem toho sa ukázalo, že CRISPR/Cas9 je súčasťou adaptívneho imunitného systému vďaka svojej špecifickosti pre cieľové gény (Chen a Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 pozostáva z Cas9 a jednej vodiacej RNA (sgRNA). Cas9 je endonukleáza zložená z viacerých proteínových zložiek. Okrem toho má Cas9 jedinečné štrukturálne a konformačné vlastnosti (Pacesa a kol., 2022), pretože pozostáva z dvoch lalokov: rozpoznávacieho (REC) a nukleázového (NUC). Lalok REC je ďalej rozdelený do troch oblastí: REC1, REC2 a mostíkových helixov (Cromwell a kol., 2018). NUC pozostáva z troch lalokov, a to RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH a interakčnej domény protospacer adjacent motif (PAM) (Obr. 1) (Song a kol., 2016). sgRNA pozostáva z dvoch zložiek, vrátane CRISPR RNA (crRNA) a transkódujúcej malej RNA (tracer RNA) (Obrázok 1). SgRNA spája proteín Cas9 s konexínmi a vytvára aktívny komplex, známy aj ako efektorový komplex (Richter a kol., 2012). crRNA je 18–20-nukleotidový pár báz, ktorý hrá kľúčovú úlohu pri rozpoznávaní cieľových sekvencií DNA. Okrem toho sa crRNA páruje s cieľovou DNA a tracrRNA pôsobí ako lešenie pre nukleázu Cas9, ktorá sa viaže na cieľovú DNA (Manghwar a kol., 2019). Na druhej strane, sekvencia PAM má 3 nukleotidy, čo potvrdzuje, špecifikuje a sprostredkováva väzbu efektorového komplexu na DNA. Podjednotky RuvC a HNH proteínového komplexu Cas9 majú katalytickú aktivitu (Richter a kol., 2012; Asmamaw a Zawdie, 2021). Nukleázová doména HNH podjednotky Cas9 štiepi vlákno DNA spojené s crRNA. Nukleázová doména RuvC štiepi iné vlákna DNA a generuje dvojvláknové zlomy (DSB), po ktorých sa aktivujú dva rôzne mechanizmy opravy zlomov DNA (Jiang a Doudna, 2017) (obrázok 1).
Obrázok 1. Prehľad CRISPR/Cas9 (A). Komponenty systému CRISPR/Cas9: (i). Endonukleáza Cas9 je zodpovedná za štiepenie cieľovej sekvencie DNA, (ii) jediná vodiaca (sg) RNA, ktorá vzniká fúziou chimér crRNA a tra-crRNA. (dve). Cas9 obsahuje niekoľko komponentov, ako napríklad Rec I, Rec II, NUC lalok (HNH a Ruv C sú podkomponenty) a interakčnú doménu PAM (C) so zodpovedajúcimi funkciami. Proteínový komplex CRISPR/Cas9 štiepi sekvencie DNA na nekomplementárne a komplementárne formy (D). CRISPR/Cas9 upravuje genóm v troch fázach: rozpoznávanie, štiepenie a oprava. Navrhnutá sg-RNA vedie Cas9 a rozpoznáva požadovanú sekvenciu prostredníctvom komplementárnej zložky crRNA. Cas9 rozpoznáva sekvenciu PAM na 5′-NGG-3′ a roztaví DNA, čím vytvorí hybrid DNA-RNA a aktivuje štiepenie. Doména HNH v Cas9 štiepi komplementárny reťazec a doména RuvC štiepi nekomplementárny reťazec. CRISPR/Cas9 opravuje dvojvláknovú DNA jej rozbitím dvoma spôsobmi: spájaním nehomologických koncov (NHEJ) a homológiou riadenou opravou (HDR). NHEJ opravuje dvojvláknovú DNA v neprítomnosti cudzej homológnej DNA prostredníctvom enzymatického procesu, čo je mechanizmus náchylný na chyby, ktorý dokáže vložiť alebo odstrániť náhodné sekvencie DNA. HDR je veľmi špecifická a vyžaduje homológne templáty DNA.
Opravné dráhy sprostredkované CRISPR/Cas9 zahŕňajú mechanizmy nehomologického spájania koncov (NHEJ) a homológiou riadenej opravy (HDR). NHEJ je dráha náchylná na chyby, pretože zahŕňa inzerciu alebo deléciu a nevyžaduje žiadny vzorec počas opravného mechanizmu. Na generovanie štandardných proteínov používa náhodné nukleotidy (Abbasi a kol., 2021). Tento opravný systém pozostáva zo štyroch komplexov, ako je komplex KU, krížovo komplementačný proteínový komplex typu 4 (XRCC-4), enzým spracovávajúci konce DNA a proteínkináza DNA-PKcs (Abbasi a kol., 2021). Proteín komplexu KU má dve podjednotky, Ku 70 a Ku 80, a hrá dôležitú úlohu v mechanizme NHEJ, pretože mechanizmus opravy sa iniciuje väzbou dvoch podjednotiek (Ku 70 a Ku 80) na tupé alebo takmer tupé konce cieľovej DNA (Abbasi a kol., 2021), ktoré slúžia ako lešenie na nábor ďalších faktorov súvisiacich s NHEJ do miesta poškodenia (Yang a kol., 2020). XRCC-4 a DNA ligáza sa skladajú z 334, respektíve 911 aminokyselín a komplex XRCC4-DNA ligáza IV stimuluje ligáciu koncov DNA (Chatterjee a kol., 2015). Enzým spracovávajúci konce DNA, tiež známy ako polynukleotidkináza 3'-fosfát, je enzým spracovávajúci konce DNA. Počas opravy DSB dokáže odstrániť 3'P skupinu v DNA a fosforylovať 5'OH skupinu. Zahŕňa tiež opravu jednovláknových zlomov (SSB) pomocou opravnej dráhy SSB (Chatterjee a kol., 2015). Proteínkináza DNA-PKcs je DNA-dependentná proteínkináza, ktorá pozostáva z katalytickej podjednotky rodiny PIKK (kinázy súvisiace s fosfatidylinositol 3-kinázou) a ataxia teleangiectasia mutated (ATM), ako aj z ATR súvisiacich s ATM a Rad3, zlomov jednovláknových zlomov (DSB) a jednovláknových zlomov (Yue a kol., 2020; Peng a kol., 2016).
HDR je presnejší a vhodnejší mechanizmus opravy, pretože informácia sa kopíruje pomocou intaktnej formy homológneho duplexu DNA, hoci vyžaduje prítomnosť sesterských chromatíd. Toto sa deje počas fázy S/G2 bunkového cyklu cicavcov. HDR sa vyskytuje hlavne u kvasiniek, ale NHEJ je kritická u cicavcov (Burma a kol., 2006; Abbasi a kol., 2021). Kompletný mechanizmus opravy je znázornený na obrázku 1.
Keďže TNBC je spôsobená genetickými a epigenetickými abnormalitami, korekcia malígnych genomických/epigenomických abnormalít pomocou CRISPR/Cas9 môže byť rozumným terapeutickým prístupom (Chen a kol., 2019). Okrem toho niektoré transkripčné faktory zapojené do bunkovo-špecifickej transkripčnej regulácie môžu vykazovať jedinečné vlastnosti rakovinových buniek, čo naznačuje, že transkripčná regulácia môže byť vynikajúcim prístupom k liečbe rakoviny (Drost a kol., 2017). Využitie týchto molekulárnych vlastností nádorov, ako sú genetické, epigenetické a transkripčné defekty, na vývoj liekov môže zlepšiť klinické výsledky a znížiť náklady na skríning. CRISPR je potenciálny nástroj na editáciu génov, ktorý dokáže nielen detegovať a identifikovať genomické ciele spôsobujúce rakovinu, ale môže sa použiť aj na editáciu, potlačenie a epigenetickú modifikáciu onkogénov v ľudských bunkách (Tabuľka 1) (Ahmed a kol., 2021). Bolo vykonaných niekoľko skríningov CRISPR na hľadanie génov spojených s tumor-supresormi, onkogénmi a rezistenciou na lieky. Použitie CRISPR/Cas9 na úpravu rôznych onkogénov TNBC je znázornené na obrázku 2.
Obrázok 2. Génová editácia rôznych onkogénov TNBC pomocou CRISPR/Cas9, ktorá vedie k zníženiu rastu nádoru a metastáz. Medzi tieto onkogény patria CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 a CXCR7, Crypto1, ROR1 a ST8SIA, ktoré sa podieľajú na výskyte a metastázovaní TNBC.
Migrácia, invázia a epitelovo-mezenchymálny prechod (EMT) rakovinových buniek sú spojené s ITGA9. Predchádzajúce štúdie ukázali, že ITGA9 je kľúčovým hráčom v dráhe Notch a hrá zaujímavú úlohu v metastázovaní rabdomyosarkómu (Molist a kol., 2020). Okrem toho sa zistilo, že ITGA9 úzko súvisí s prognózou pacientky pri niekoľkých typoch nádorov vrátane rakoviny prsníka (Wang Z. a kol., 2019). Bioinformatická analýza ITGA9 navyše ukázala, že jeho expresia v TNBC bola významne vyššia ako v iných podtypoch rakoviny prsníka. Zvýšené hladiny ITGA9 sú spojené s metastázami a relapsom nádoru u pacientok s TNBC. Vyradenie ITGA9 pomocou CRISPR/Cas9 viedlo k vlastnostiam podobným rakovinovým kmeňovým bunkám (CSC), angiogenéze nádoru, rastu nádoru a zníženiu metastáz podporovaním degradácie β-katenínu v TNBC (Wang Z. a kol., 2019).
Crypto-1 je členom rodiny TGF-β a je kritický pre skorú embryogenézu, udržiavanie kmeňových buniek a metastázy rakoviny (Ishii a kol., 2021). Tiež známy ako Tdgf-1, je to onkogénny signálny proteín ukotvený v GPI, ktorý sa podieľa na regulácii tvorby primitívneho pruhu, mezodermu a endodermu, ako aj na stanovení ľavostrannej/pravostrannej asymetrie vo vývoji telesných orgánov počas embryogenézy (Zhang a kol., 2021b). Okrem toho sa ukázalo, že Cripto-1 sa podieľa na epitelovo-mezenchymálnej transformácii (EMT) ako marker kmeňových buniek (Zhang a kol., 2021b). EMT je kritický nielen pre rôzne procesy, ako je embryonálny vývoj, fibróza a hojenie rán, ale aj pre inváziu a metastázy rakoviny. Okrem toho sa ukázalo, že Cripto-1 interaguje so štyrmi Notch receptormi a zvyšuje ich posttranslačné dozrievanie (Brandstadter a Maillard, 2019). Je známe, že signálna dráha Notch sa podieľa na udržiavaní ľudských buniek rakoviny prsníka. Štúdie ukázali, že knockout Crypto-1 sprostredkovaný CRISPR/Cas9 potláča rast a metastázy rakoviny. Crypto-1 sa preto môže stať dôležitým terapeutickým cieľom pre TNBC (Castro a kol., 2015).
Proteín XCL12 a jeho chemokínový receptor CXC (CXCR4 a CXCR7) hrajú rôzne úlohy v proliferácii, raste, migrácii a invázii rakovinových buniek (Wu a kol., 2015). Tieto chemoreceptory boli spojené s vývojom TNBC prostredníctvom viacerých signálnych dráh v modeloch in vivo aj in vitro (Wu a kol., 2015). Okrem toho je aktivácia CXCR4 a CXCR7 spojená s väčšou náchylnosťou na metastázy a zlou prognózou pri TNBC (Karn a kol., 2022). Preto sa knockout CXCR4 a CXCR7 môže stať účinnými cieľovými génmi pre liečbu rakoviny prsníka vrátane TNBC. Štúdia Yang a kol. Yang a kol. (2019) použili CRISPR/Cas9 na spoločné knockoutovanie génov CXCR4 a CXCR7 a zistili, že proliferácia, rast, migrácia a invázia TNBC boli významne inhibované (Yang a kol., 2019).
Zvýšené hladiny miR-3662, onkogénu TNBC, boli pozorované v tkanivách rakoviny prsníka (Yi a kol., 2022). Ukázalo sa, že knockdown miR-3662 inhibuje rast a metastázy nádoru prsníka in vivo aj in vitro (Agarwal a Gupta, 2021). HBP-1 je silný inhibítor signalizácie Wnt/-katenín a je pravdepodobne zodpovedný za rast buniek TNBC sprostredkovaný miR-3662. Nedávno Yi a kol. zistili, že os miR-3662-HBP1 reguluje signálnu dráhu Wnt/-katenín v bunkách TNBC (Yi a kol., 2022). Vďaka svojej nádorovo špecifickej expresii môže byť miR-3662 potenciálnym terapeutickým cieľom pre TNBC. Knockdown miR-3662 sprostredkovaný CRISPR/Cas9 môže byť preto vynikajúcim prístupom k vývoju nových liekov na liečbu TNBC.
UBR5 je 300 kDa nukleofosfoproteín, ktorý bol identifikovaný ako kľúčový regulátor tumorigenézy, metastáz a imunitnej odpovede pri rôznych druhoch rakoviny (Shearer a kol., 2015; Fu a kol., 2023). Bolo hlásené, že UBR5 je vysoko upregulovaný vo vzorkách TNBC a stimuluje funkciu ERα indukciou proliferácie prostredníctvom svojej ubikvitín ligázovej aktivity (Bolt a kol., 2015). Štúdie sekvenovania celého exómu primárnych vzoriek TNBC tiež preukázali zvýšenú expresiu UBR5, čo naznačuje jeho úlohu vo vývoji TNBC. Okrem toho, delécia UBR5 riadená CRISPR/Cas9 preukázala významnú inhibíciu metastáz a rastu TNBC v experimentálnych myšacích modeloch. Okrem toho, zahrnutie UBR5 do myšacieho modelu divokého typu obnovilo jeho plnú funkčnosť, zatiaľ čo tento účinok nebol pozorovaný u inaktivovaných mutantných kmeňov (Liao a kol., 2017). Nedostatok UBR5 je spojený so zvýšenou apoptózou, nekrózou a inhibíciou rastu nádoru pri TNBC v dôsledku slabej angiogenézy. V dôsledku straty UBR5 je znížené šírenie nádoru do vzdialených orgánov a UBR5 indukuje abnormálny EMT najmä znížením expresie E-kadherínu (Zhang a Weinberg, 2018). Nedávno sa ukázalo, že UBR5 je veľmi dôležitým faktorom v transkripcii PDL1 indukovanej IFN-γ pri TNBC kvôli jeho nedostatočnej ubikvitinačnej aktivite E3. Analýza RNA transkriptómu odhalila, že UBR5 môže mať systémové účinky na gény spojené s dráhou IFN-γ a podporovať transaktiváciu PDL1 zvýšením hladín aktivácie proteínkinázy RNA (PKR) a jej signálnych prevodníkov a aktivátorov, transkripcie 1 (STAT1) a regulačného faktora interferónu 1 (IRF1). Kombinovaná ablácia expresie UBR5 a PD-L1 sprostredkovaná CRISPR/Cas9 však má synergický terapeutický účinok ako samotná blokáda s výraznými účinkami na mikroprostredie nádoru (Wu a kol., 2022). CRISPR/Cas9 teda môže byť dôležitým nástrojom na inhibíciu funkcie UBR5, čím sa potláčajú metastázy TNBC a rast nádoru.
ROR1 je transmembránový proteín typu I, ktorý sa exprimuje počas rakoviny a embryonálneho vývoja a bol identifikovaný ako onkofetálny proteín (Nicholas Borcherding, 2014). Invazívne správanie rôznych druhov rakoviny u ľudí je spojené so zvýšenou reguláciou ROR1. Sľubné výsledky sa získali zo štúdií in vivo a in vitro zahŕňajúcich terapeutické zlúčeniny zamerané na ROR1 (Chien a kol., 2016). Zvýšené hladiny mRNA ROR1 v biopsiách prsného tkaniva sa tiež spájajú s agresívnymi bazálnymi nádormi prsníka (BL) a ich migráciou do iných častí tela. Okrem toho bola nadmerná expresia ROR1 identifikovaná ako prognostický marker pre rozvoj TNBC (Chien a kol., 2016). Účinnou stratégiou by však bolo umlčanie ROR1 pomocou CRISPR/Cas9 na potlačenie rastu a metastáz TNBC.
Proces sialylácie zahŕňa adíciu kyseliny sialovej na glykokonjugáty, ktorú katalyzujú sialyltransferázy (ST). ST8SIA1 patrí do rodiny ST a hrá dôležitú úlohu v patogenéze rôznych ochorení, ako je lymfocytová leukémia a kolorektálny karcinóm (Chang a kol., 2018). Analýza RNA sekvencie ukazuje, že ST8SIA1 je vysoko exprimovaný v tkanive prsníka pacientok s TNBC a pozitívne koreluje s mutáciami v géne tumor supresora p53, čo môže prispievať k patogenéze TNBC (Battula a kol., 2017). Okrem toho sa ST8SIA1 podieľa na metastázovaní a recidíve TNBC, čo naznačuje, že hrá dôležitú úlohu pri výskyte a rozvoji TNBC. V in vitro modeli TNBC sa ukázalo, že knockdown ST8SIA1 pomocou CRIPSR/Cas9 blokuje rast a metastázy (Battula a kol., 2017). To naznačuje, že CRISPR/Cas9 môže byť dôležitým nástrojom na inhibíciu funkcie onkogénu ST8SIA1 pri liečbe TNBC.
NAT1 je metabolický enzým, ktorý katalyzuje tvorbu xenobiotických zlúčenín fázy II a je exprimovaný takmer vo všetkých ľudských tkanivách. NAT1 môže použiť kofaktor folát na cielenie na acetyl-CoA (acetyl-CoA) aj v neprítomnosti aromatického amínového substrátu (Stepp a kol., 2015; Laurieri a kol., 2014). Štúdie ukázali, že NAT1 reguluje funkciu matrixovej metaloproteinázy 9 (MMP9) v modeloch buniek rakoviny prsníka a chráni pred reaktívnymi formami kyslíka (ROS) počas hladovania glukózou (Wang a kol., 2018). Ukázalo sa, že delécia NAT1 inhibuje komplex pyruvátdehydrogenázy, čo vedie k mitochondriálnej dysfunkcii (Wang L. a kol., 2019). Okrem toho rôzne ďalšie správy ukázali, že inhibícia NAT1 pomocou malých molekúl a umlčania siRNA môže znížiť invazívnosť a proliferáciu buniek rakoviny prsníka (Stepp a kol., 2018). Nedávno bol CRISPR/Cas9 použitý na potlačenie NAT1 v bunkovej línii rakoviny prsníka MDA-MB-231, pričom ovplyvnil bunkový metabolizmus v závislosti od úrovne jeho expresie. Táto štúdia tiež ukázala, že NAT-1 je kritický pre progresiu a metastázovanie TNBC (Carlisle a kol., 2020).
Koordinovaná transkripcia onkogénov je regulovaná super enhancermi, transkripčnými faktormi a kofaktormi (Hnisz a kol., 2015). Okrem toho je na transkripčnú reguláciu potrebná skupina cyklín-dependentných kináz (CDK), ako napríklad CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 a CDK13. Spomedzi nich sa CDK7 podieľa na fosforylácii RNA polymerázy II, ktorá je veľmi dôležitá pre iniciáciu a expanziu transkripcie onkogénov v patogenéze TNBC. V prelomovej štúdii delécia CDK7 pomocou CRISPR/Cas9 inhibovala TNBC, čo naznačuje, že patogenéza TNBC je závislá od CDK7 (Wang Y. a kol., 2015).
Štúdie ukázali, že mutácie v MYC a RBP (RNA viažuci proteín) môžu viesť k apoptóze, zatiaľ čo mutácie jednotlivých génov v MYC alebo RBP neovplyvňujú rast rakovinových buniek (Einstein a kol., 2021). Viac ako 1000 RBP v ľudskom genóme bolo skrínovaných pomocou knižnice založenej na CRISPR/Cas9. Z nich sa zistilo, že 57 RBP je kritických pre rast rakovinových buniek s vysoko zvýšenými hladinami MYC (Wheeler a kol., 2020). Okrem toho je YTHDF2 dôležitý pre udržanie rastu buniek TNBC a znižuje množstvo metylovaných transkriptov počas transkripcie a translácie na vysokej úrovni v rakovinových bunkách s vyššou expresiou MYC. Okrem toho YTHDF2 nie je nevyhnutný pre rakovinové bunky, ktoré sú menej závislé od zvýšených hladín MYC na predĺženie prežitia pacientov s TNBC (Einstein a kol., 2021), čo naznačuje, že by mohol byť potenciálnym terapeutickým cieľom pre lieky, ktoré dokážu prekonať TNBC.
Zinkové prstové proteíny (ZNF) tvoria približne 1 % celkového ľudského genómu. Štúdie ukázali, že ZNF môže regulovať proliferáciu buniek pri rôznych druhoch rakoviny, ako je rakovina pečene, rakovina prsníka a kolorektálny karcinóm (Zhang W. a kol., 2021; Li a kol., 2017). Knižnice vytvorené knockoutom CRISPR sa použili na skríning rôznych génov potláčajúcich nádory (TSG) v bunkách rakoviny prsníka (Shalem a kol., 2014). Odvtedy transkriptomická štúdia buniek rakoviny prsníka s deléciou ZNF319 v CRISPR/Cas9 ukázala, že ZNF319 je gén potláčajúci nádory, ktorý znižuje proliferáciu rakoviny prsníka, a preto sa podieľa na rôznych potenciálnych signálnych mechanizmoch a iných biologických funkciách (Wang L. a kol., 2022).
Feroptóza je typ programovanej bunkovej smrti, ktorá je závislá od prítomnosti železa. Je známe, že vývoj feroptózy je ovplyvnený prítomnosťou lipidových peroxidov. Okrem toho sa uvádza, že PKCβII vykazuje skorú lipidovú peroxidáciu a zvýšená lipidová peroxidácia je spojená s feroptózou. Skríning knižnice inhibítorov kinázy sprostredkovaných CRISPR/Cas9 odhalil, že PKCβII sa podieľa na procese lipidovej peroxidácie, ktorá je kritická pre feroptózu v bunkách MDA-MB-231 (Zhang a kol., 2022). To naznačuje, že knockout PKCβII pomocou CRISPR/Cas9 môže byť potenciálnym cieľom génu tumor supresora pre liečbu ochorení súvisiacich s feroptózou (Zhang a kol., 2022).
Predpokladá sa, že lieková rezistencia je zodpovedná za približne 90 % úmrtí u pacientov s rakovinou a je jednou z hlavných výziev v liečbe rakoviny (Bukowski a kol., 2020). Výsledky naznačujú, že s liekovou rezistenciou je spojený dostatočný počet génov súvisiacich s efluxom liekov, opravou DNA, apoptózou a rôznymi bunkovými signálnymi dráhami (Haider a kol., 2020). Spomedzi nich bolo niekoľko génov cielených nástrojmi CRISPR/Cas9 a preukázali sľubné výsledky pri znižovaní liekovej rezistencie a zvyšovaní účinnosti protirakovinovej liečby (Vaghari-Tabari a kol., 2022). Okrem toho sa ukázalo, že vysoko výkonné skríningové knižnice CRISPR/Cas9 na knockout gény sa podieľajú na modifikácii funkcie potenciálnych cieľových génov liekovej rezistencie (Shalem a kol., 2015). Na identifikáciu génov rezistencie na paklitaxel sa použilo sekvenovanie RNA spojené so skríningom knižnice sgRNA v celom genóme na identifikáciu ôsmich kandidátskych génov vrátane históndeacetylázy 9 (HDAC9), ktoré sú spojené s rezistenciou na lieky u pacientov s rekurentným TNBC (B a kol., 2020). V inej štúdii sa pozorovala zvýšená expresia diserín/treonín a tyrozín proteínkinázy (DSTYK) počas prežívania pacientov s TNBC liečených protirakovinovými liekmi. Okrem toho, knockdown DSTYK sprostredkovaný CRISPR/Cas9 významne zvýšil apoptózu rakovinových buniek rezistentných na lieky in vitro (bunky SUM102PT a bunky MDA-MB-468) a in vivo model TNBC (Ogbu a kol., 2021).
Hoci TNBC má abnormálnu aktiváciu dráhy MAPK, klinický účinok terapií zameraných na MEK je slabý. Skríning genomickej knižnice CRISPR/Cas9 ukázal, že inhibícia PSMG2 (chaperón 2 zostavy proteómu) senzibilizuje bunky TNBC BT549 a MB468 na inhibítor MEK AZD6244. Zníženie expresie PSMG2 pomocou CRISPR/Cas9 zmenilo normálnu funkciu proteazómu, čo viedlo k autofágiou sprostredkovanej demontáži PDPK1, čím sa ďalej zlepšili nádorové bunky v myších modeloch TNBC indukovaných AZD6244 (inhibítor MEK) a MG132 (inhibítor proteazómu). Inhibítory proteazómu a MAP kinázy (MEK) sa teda môžu podávať synergicky na zníženie proliferácie nádorových buniek (Wang X. a kol., 2022).
CRISPR/Cas9 sa tiež používa na skríning straty génovej funkcie vedúcej k rezistencii TNBC (Shu a kol., 2020). Ge a kol. vysvetlili mechanizmus liekovej rezistencie rakovinových buniek liečených JQ1, inhibítorom BET bromodomény (BBDI), pri TNBC. Pomocou CRISPR/Cas9 zistili, že delécia génu rb1 spôsobila, že TNBC sa stala rezistentnou na protirakovinový liek JQ1. Preto je funkcia rb1 dôležitá v odpovedi na lieky JQ1 pri TNBC. Tiež uviedli, že paklitaxel je inhibítor kinázy/mikrotubulov CDK4/6 a jeho kombinácia s BBDI, ako je JQ1, môže poskytnúť sľubné terapeutické odpovede na TNBC rezistentný na lieky (Ge a kol., 2020).
Bolo hlásené, že transkripčná krajina dlhej nekódujúcej RNA (lncRNA) je zodpovedná za rezistenciu na neoadjuvantnú liečbu pri TNBC. Táto štúdia ukazuje, že päť rôznych transkriptov MALAT1 lncRNA je vysoko exprimovaných pri TNBC. Okrem toho, delécia MALAT1 sprostredkovaná CRISPR/Cas9 zvýšila citlivosť buniek TNBC BT-549 na paklitaxel a doxorubicín, čo naznačuje potenciálnu úlohu rezistencie MALAT1 pri TNBC (Shaath a kol., 2021).
Mutácie v géne BRCA1 (BRCA1m) sú heterogénne, a preto je ťažké ich zistiť. Zameranie sa na PARP1 (poly(ADP-ribóza) polymeráza), syntetického letálneho partnera BRCA1, môže zvýšiť chemosenzitivitu liekov v bunkách TNBC. Použitím CRISPR/Cas9 delécia PARP1 zvýšila citlivosť protirakovinových liekov, ako je doxorubicín, gemcitabín a docetaxel, na bunky TNBC s mutáciou mBRCA1, čo naznačuje, že PARP1 sa podieľa aj na rezistencii na lieky v bunkách TNBC (Vaghari-Tabari a kol., 2022). Je známe, že mutácie v génoch supresorov nádorov BRCA1 alebo BRCA2 zvyšujú pravdepodobnosť vzniku rakoviny prsníka u ľudí. Liečba týchto pacientok vyžaduje použitie inhibítorov PARP. Okrem toho sa preukázalo, že knockout nukleotidového záchranného faktora DNPH1 pomocou CRISPR/Cas9 môže odstrániť toxický nukleotid 5-hydroxymetyldeoxyuridín (hmdU) monofosfát, čím sa zvyšuje reakcia buniek s deficitom BRCA na citlivosť na inhibítory PARP (Fugger a kol., 2021). Inhibítory CRISPR/Cas9 a PARP1 sa teda môžu stať dôležitou liečebnou stratégiou pre TNBC.
Gén penetračného glykoproteínu (P-gp) je gén multiliekovej rezistencie, ktorý je vo všeobecnosti upregulovaný u približne 41 % všetkých TNBC (Sun a kol., 2020). Eflux liekov indukovaný P-gp bol identifikovaný ako kľúčový regulátor liekovej rezistencie pri rakovine prsníka. Inhibítory P-gp preukázali zvýšenú citlivosť na protirakovinové lieky pri rakovine prsníka (Famta a kol., 2021). Ablácia alebo supresia P-gp a inhibítorov P-gp sprostredkovaná CRISPR/Cas9 môže byť preto veľmi dôležitými metódami na prekonanie liekovej rezistencie pri TNBC.
Je známe, že ATP-viažuci kazetový transportér G2 (ABCG2) spôsobuje rezistenciu na lieky pri TNBC (Palasuberniam a kol., 2015), hoci v súčasnosti neexistujú žiadne správy o vzťahu medzi umlčaním CRISPR/Cas9 a ABCG2 a inaktiváciou génov supresorov nádorov. PTEN môže zvýšiť aktiváciu ABCG2 (Palasuberniam a kol., 2015), (Deepak Singh a kol., 2021). Preto použitie CRISP/Ca9 na odstránenie ABCG2 a jeho kombinácia s inhibítorom ABCG2 môže byť vhodnou liečbou na prekonanie rezistencie na lieky pri TNBC. Tabuľka 2 uvádza CRISPR/Cas9 zameraný na všetky gény rezistencie.
Tabuľka 2. CRISPR/Cas9 sa zameriava na rôzne gény rezistencie TNBC s cieľom senzibilizovať bunky na protirakovinové lieky.
Knižnice CRISPR/Cas9 sú potenciálnymi nástrojmi na skríning génových mutácií spojených s patogenézou rakoviny (Chan a kol., 2022). Táto skríningová metóda zahŕňa štyri kroky, ako napríklad (a) konštrukciu knižnice, (b) lentivírusovú transdukciu, (c) fenotypový skríning a (d) analýzu cieľového génu. Hoci TNBC má abnormálnu aktiváciu dráhy MAPK, klinická prognóza cielenej terapie MEK u pacientov s TNBC s mutáciami v tumor-supresorových génoch, ako sú PTEN, RB1 a TP53, je veľmi zlá.
Okrem toho, skríning génových knockoutov pomocou CRISPR/Cas9 testoval najúčinnejšiu a najselektívnejšiu molekulu, dehydrokatrol, ktorá sa hojne vyskytuje v guatemalských kvetových a listových extraktoch, aby sa pochopil vplyv dehydrokatrolu na MDA-MB-231. Mechanizmy selektívnej bunkovej cytotoxicity. Charakteristiky mezenchymálnej kmeňovej štruktúry podtypov TNBC. Tento skríning založený na CRISPR/Cas9 tiež odhalil, že HSD17B11, gén kódujúci 17β-hydroxysteroid dehydrogenázu typu 11, je vysoko exprimovaný v bunkách MDA-MB-231 a vedie k dehydrofalkarinolu špecifickému pre bunky MDA-MB-231 (Grant a kol., 2020). To naznačuje, že genomický skríning CRISPR/Cas9 má veľký potenciál pri identifikácii mechanizmov, ktoré sú základom protirakovinových vlastností potenciálnych prírodných zlúčenín.
Okrem toho bola skúmaná zraniteľnosť TNBC voči rakovine pomocou nestranného celogenómového in vivo CRISPR/Cas9 skríningu, ktorý preukázal súvislosť medzi onkogénnymi a tumor-supresorovými dráhami. Bolo hlásené, že kľúčové zložky dráh mTOR a Hippo hrajú dôležitú úlohu v regulácii nádoru pri TNBC. Štúdie navyše ukázali, že farmakologická inhibícia onkoproteínu mTORC1/2 a YAP účinne inhibuje patogenitu TNBC pomocou in vitro modelu synergie liečivo-matrica a in vivo xenograftov odvodených od pacienta. Inhibícia mTORC1/2 sprostredkovaná Torin-1 navyše zvyšuje makropinocytózu, zatiaľ čo inhibícia YAP indukovaná verteporfínom vedie k bunkovej smrti TNBC. Tieto výsledky spoločne zdôrazňujú silu a robustnosť celogenómového in vivo CRISPR skríningu pri identifikácii nových a účinných liečebných postupov pre TNBC (Dai a kol., 2021).
Dysregulácia imunitného systému je dôležitým faktorom v tumorigenéze. Rakovinové bunky sa vyhýbajú imunitnému odbúravaniu obranných mechanizmov vrátane narušenia aktivity imunitných buniek v nádorovom mikroprostredí a ohrozenia imunitného systému. Preto môže byť vývoj zlepšeného imunitného systému kľúčovým prístupom k boju proti nádorom. Použitie génovej modifikácie založenej na CRISPR/Cas9 rieši niekoľko problémov súvisiacich s imunitnou dysfunkciou z rôznych perspektív. CRISPR/Cas9 sa používa na zlepšenie protinádorovej imunity proti rakovine prsníka prostredníctvom nasledujúcich dráh (obrázok 3).
Obrázok 3. Imunoterapia CRISPR/Cas9 je zameraná na bunky TNBC. Strata CDK5 a zníženie expresie PDL1 a CD155 posilňujú imunitný systém. Podobne strata A2AR a zníženie expresie TAA, ako sú HER2, mucín 1 a TEM8, zvýšili účinnosť buniek CAR-T pri usmrcovaní rakovinových buniek. Skríning buniek T pomocou CRISPR/Cas9 ukázal, že narušenie kinázy p38 zvyšuje protinádorovú aktivitu buniek T. Bunky T modifikované CRISPR/Cas9 zvyšujú expresiu TCR (receptor buniek T), čo vedie k protinádorovej aktivite buniek T.
Cieľom imunoterapie je stimulovať imunitný systém k útoku na rakovinové bunky. Nadmerná expresia imunitných kontrolných proteínov zvyčajne zabraňuje autoimunitným reakciám, ale môže pomôcť rakovine vyhnúť sa im (Topalian a kol., 2015). Tieto proteíny zabraňujú imunitným reakciám väzbou na receptory na povrchu imunitných buniek. Viaceré kontrolné proteíny (ako napríklad CD155 a PD-L1) sa zameriavajú na receptor PD-1 na imunitných bunkách a sú exprimované v rakovine prsníka, najmä TNBC (Li Y.-C. a kol., 2020). Zníženie expresie PD-L1 alebo jeho receptora pomocou CRISPR/Cas9 môže stimulovať imunitný systém k útoku na nádory TNBC (Yahata a kol., 2019). Okrem toho sa ukázalo, že zníženie expresie PD-L1 prostredníctvom delécie CDK5 sprostredkovanej CRISPR/Cas9 inhibuje rast nádoru in vitro a in vivo (Deng a kol., 2020). Inhibícia rastu v in vitro a in vivo modeloch rakoviny prsníka naznačuje, že redukcia CD155 sprostredkovaná shRNA môže mať terapeutický účinok na rakovinu prsníka (Gao a kol., 2018).
CAR T bunky exprimujú CAR, ktoré rozpoznávajú antigény asociované s nádorom (TAA) a môžu využiť knockdown kontrolných proteínov na zvýšenie svojej aktivity (Li C. a kol., 2020). Existujú rôzne potenciálne ciele pre terapiu CAR T bunkami pri rakovine prsníka, vrátane niekoľkých TAA, ako sú HER2, mucín 1 a TEM8 (Bajgain a kol., 2018). Existujú dôkazy, že CAR T bunky zamerané na mezotelín (nadmerne exprimovaný v bunkách TNBC BT-459) sú účinnejšie proti rakovine, keď je PD-1 knock-up pomocou CRISPR/Cas9 (Hu a kol., 2019). Izolácia T buniek od pacientov a ich následná úprava ex vivo je však prácny a časovo náročný proces. Hoci univerzálne T bunky môžu znížiť požiadavky na izoláciu, darcovské T bunky exprimujúce ľudský leukocytový antigén (HLA) triedy I a T bunkový receptor (TCR) by sa mali odstrániť, aby sa zabránilo abnormalitám štepu proti hostiteľovi (Ren a kol., 2017, 2017a). Pomocou CRISPR/Cas9 dokáže HDR súčasne eliminovať TCR a HLA a vyradiť gén kódujúci CAR. Štúdie ukázali, že CRISPR/Cas9 sa dá použiť na zavedenie anti-CD19 CAR do lokusu TCR, čím sa efektívne produkujú CAR bez deplécie T buniek (Dimitri a kol., 2022). Boli vyvinuté multiplexné technológie na generovanie alogénnych CAR T buniek súčasnou elimináciou TCR, beta-2-mikroglobulínu (B2M), podjednotky HLA-I a ďalších proteínov, ako sú PD-1 a CTLA-4, ktoré môžu mať lepšie protirakovinové vlastnosti proti TNBC (Eyquem a kol., 2017; Liu a kol., 2017; Ren a kol., 2017b; Dimitri a kol., 2022).
Použitie CRISPR/Cas9 by mohlo zlepšiť účinnosť CAR-T buniek. Je známe, že adenozín má imunosupresívne vlastnosti a môže znižovať protirakovinovú imunitu blokovaním funkcie T buniek a aktiváciou adenozínových receptorov A2A (A2AR) (Vigano a kol., 2019). Utlmenie A2AR pomocou CRISPR/Cas9 významne zlepšilo účinnosť CAR-T buniek in vivo (Giuffrida a kol., 2021). Je známe, že T bunky vykazujú rôzne fenotypové charakteristiky, ako je bunková expanzia, diferenciácia, oxidačný stres a genomický stres. Skríning T buniek založený na CRISPR/Cas9 odhalil narušenie 25 rôznych kináz T bunkových receptorov. Medzi nimi sa ukázalo, že delécia p38 kinázy zvyšuje protinádorovú aktivitu T buniek, čo naznačuje, že p38 kináza je kľúčovým regulátorom regulácie CAR-T buniek (Gurusamy a kol., 2020).
T bunky je možné geneticky modifikovať pomocou CRISPR/Cas9 za účelom produkcie vysoko exprimovaných TCR. Prenos geneticky modifikovaných T buniek pacientom preukázal silnejšiu protirakovinovú aktivitu ako endogénne T bunky. Preto môžu endogénne TCR konkurovať geneticky modifikovaným TCR u pacientov, čo môže mať vplyv na potenciál imunoterapie rakoviny. Na prekonanie tohto problému môže použitie CRISPR/Cas9 na odstránenie endogénneho TCR-β v bunkách príjemcu a následný prenos TCR-β T buniek pacientom s rakovinou vykazovať lepšie protirakovinové imunitné odpovede bez potreby endogénnej sexuálnej konkurencie TCR (Fan a kol., 2018). S výnimkou T buniek modifikovaných CRISPR sú teda TCR tisíckrát citlivejšie na nádorové antigény ako normálne T bunky transdukované TCR. Okrem toho pri rôznych leukémiách vykazujú zmenené T bunky generované pomocou γδ TCR+ CRISPR vyššiu expresiu CD4+ a CD8+ T buniek ako štandardný prenos TCR (Legut a kol., 2018). Modifikované T bunky generované pomocou CRISPR/Cas9 teda môžu byť účinnou imunoterapeutickou metódou na prekonanie TNBC.
Integríny sú molekuly bunkovej adhézie, ktoré sú prítomné v bunkových transmembránach a podporujú väzbu buniek na extracelulárnu matricu (ECM) (Hamidi a Ivaska, 2018). Dysregulácia integrínov je spojená s rozvojom a migráciou rakoviny zmenou extracelulárnej matrice, čo vedie k prežitiu rakovinových buniek v krvnom obehu (Hamidi a Ivaska, 2018). Zníženie hladiny integrínu sprostredkované CRISPR/Cas9 spomaľuje progresiu nádoru, metastázovanie a kolonizáciu pri TNBC. Bolo hlásené, že zníženie hladiny integrínu a5 (ITGA5) znižuje migráciu a progresiu buniek pri iných druhoch rakoviny, ako je rakovina pľúc (Ju a kol., 2017), čo naznačuje, že integrín a5 môže byť tiež kľúčovým faktorom v patogenéze TNBC.
Generovanie knockout myší pomocou tradičných metód embryonálnych kmeňových (ES) buniek je prácny, časovo náročný a neefektívny proces. Trvá mesiace a roky, kým sa ES bunky zacielia homológnou rekombináciou, šľachtia chimérické myši a potom ich krížia s heterozygotnými myšami, aby sa získalo homozygotné potomstvo. Na vytvorenie myší s viacerými genetickými mutáciami je potrebné komplexné kríženie. Pri použití myší generovaných abláciou ES buniek pomocou CRISPR/Cas9 alebo mikroinjekciou komponentov CRISPR/Cas9 do oplodnených vajíčok s jednou bunkou však vzniklo mnoho problémov. Napríklad k zavedeniu zmien často dochádza v bialelických lokusoch a nie je to génovo špecifické. Nedávno bolo publikované, že ES bunky používajúce technológiu CRISPR/Cas9 dokážu súčasne vložiť bialelické mutácie až do 5 génov (Nishizono a kol., 2021). Na tento účel boli do ES buniek súčasne transfekované mRNA Cas9 a päť génovo špecifických gRNA. Toto zdôrazňuje sľub a účinnosť tohto postupu, hoci tieto mutácie mohli byť prenesené, keď boli zakladajúce línie krížené na produkciu päťnásobne knockoutovaných myší. Štúdia tiež uvádza prekvapivý objav: ES bunky už nie sú potrebné na vytvorenie geneticky modifikovaných myší. Namiesto toho boli na odstránenie špecifických génových produktov injekčne podané Cas9 mRNA a gRNA do embryí v štádiu jednej bunky. V dôsledku toho boli vytvorené knockoutované zakladajúce línie, ktoré možno teoreticky použiť na štúdium dôsledkov delécie génov u myší (Qin a kol., 2016). CRISPR/Cas9 teda umožňuje vytvorenie transgénnych myší na liečbu TNBC s nižšími nákladmi ako tradičné genetické inžinierstvo. Pomocou systému CRISPR/Cas bol vyvinutý nový model knockout myši, ktorý dokáže úspešne zaviesť bodové mutácie v jednom alebo viacerých endogénnych génoch v TNBC. Na základe tejto koncepcie je možné vyvinúť aj zvieracie modely TNBC pomocou CRISPR/Cas9-sprostredkovanej delécie BRCA1 a p53, čo vedie k strate opravy HR, genomickej nestabilite a mutantným fenotypom (Annunziato a kol., 2020).
V súčasnosti sa na diagnostiku TNBC používajú rôzne metódy, ako je mamografia, magnetická rezonancia (MRI) a ultrazvuk. Tieto metódy však majú určité obmedzenia. Mamografia sa používa na diagnostiku lokálneho tkaniva prsníka, a nie na diagnostiku metastáz, kde rakovinové bunky migrovali do iných orgánov. Ultrasonografia nie je spoľahlivou metódou na diagnostiku TNBC (Chen a Lee-Felker, 2023). MRI má vyššiu citlivosť ako ultrazvuk a mamografia, ale jej diagnostická presnosť je obmedzená (Sha a Chen, 2022). Biopsia tkaniva je invazívny spôsob identifikácie rakovinových buniek. V niektorých prípadoch však biopsia môže prehliadnuť rakovinové tkanivo, ak sa ihla odchýli od oblasti záujmu. Okrem toho je veľmi drahá a pre pacientku môže byť traumatická. TNBC je heterogénny typ rakoviny, takže biopsia nemusí poskytnúť dostatok informácií o type rakoviny. Preto je naliehavo potrebná nová diagnosticky spoľahlivá metóda na detekciu TNBC. CRISPR/Cas9 môže slúžiť ako vysoko citlivá a minimálne invazívna alternatíva pre diagnostiku rakoviny prsníka. Na tento účel možno stratégie založené na CRISPR/Cas9 použiť na zlepšenie metód PCR na diagnostiku TNBC. Najprv sa proteíny Cas9 a cpf1 systému CRISPR použijú na odstránenie nešpecifickej DNA a potom tieto dva proteíny (Cas9 a cpf1) dokážu rozpoznať sekvenciu PAM pred väzbou na cieľovú DNA (Deepak Singh a kol., 2021). PCR teda dokáže identifikovať mutácie spojené s rozvojom rakoviny. Niekoľko štúdií prijalo túto stratégiu založenú na CRISPR na detekciu rôznych mutácií v rôznych druhoch rakoviny (Safari a kol., 2019). Metódy PCR založené na CRISPR teda môžu znížiť závislosť diagnostiky TNBC od invazívnych metód, ako je imunohistochemické vyšetrenie na základe biopsie.
Genotypové zmeny v regulácii hormonálnych receptorov boli preukázané aj u TNBC (Chen a Russo, 2009). PCR stratégie založené na CRISPR/Cas9 s využitím mikročipov na diagnostiku v mieste starostlivosti môžu tieto mutácie účinne monitorovať (Hajian a kol., 2019). Mohli by tiež poskytnúť poskytovateľom zdravotnej starostlivosti relevantné informácie o špecifických mutáciách u pacientov s TNBC, čo by mohlo pomôcť zlepšiť priebeh ich liečby. Táto kombinovaná technika má však svoje obmedzenia. Preto je potrebné rozsiahle výskumné úsilie, kým sa táto metóda CRISPR/Cas-PCR bude môcť použiť v zdravotníctve na diagnostiku TNBC (Yang a kol., 2019).
Čas uverejnenia: 14. októbra 2024